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菊花“粉十八”组织培养技术研究

2022-08-17武颖

现代园艺 2022年14期
关键词:外植体无菌生根

武颖

(德州市城市园林规划设计研究院,山东德州 253000)

菊花属菊科多年生宿根草本植物,是我国四大传统名花(牡丹、菊花、山茶、水仙)之一,也是花中“四君子”(梅、兰、竹、菊)之一,自古以来就深受国人喜爱。我国有重阳节赏菊花、饮菊花酒的习俗,菊花栽培种植历史悠久,品种资源丰富,文化内涵深远,具有较强的观赏价值和经济价值。菊花传统繁殖方式多采用扦插繁殖和分株繁殖,繁殖周期长,受季节限制较大。近年来,随着植物组织培养技术的快速发展,因其在产业化生产、品种脱毒等方面的优势,也成为菊花新优品种、名贵稀有品种繁殖的重要途径。菊花品种“粉十八”花瓣面为玫粉红色,背粉白色,平瓣,瓣面上玫粉红色间有白色晕斑或红白晕染,瓣根多为白色。筒状花发达,露心,花姿艳丽,犹如一名翩翩起舞的少女,极具观赏价值,适合家庭盆栽养殖。本研究以“粉十八”茎尖、茎段为外植体,对其进行离体组织培养研究。

1 菊花组织培养概念和优势

1.1 菊花组织培养的概念

菊花组织培养技术,是指选取菊花茎段、茎尖、叶片、花蕾、花药等作为外植体,消毒处理后接种于人工配制、添加不同激素的培养基上进行诱导,建立无菌体系,使其再生形成完整植株的技术方法。该技术依赖于植物细胞的全能性,通过组织培养可以得到完整的菊花植株。

1.2 菊花组织培养的优势

菊花的繁殖方法较多,传统方法多采用扦插繁殖和分株繁殖,传统繁殖需要大量母本植株,周期长,受季节和环境限制大。另外,菊花病毒病种类多,使用携带病毒的母本进行扦插,会引起病毒病的扩张和蔓延,从而导致幼苗质量差,优良品种长此以往会发生退化现象。采用菊花组培技术,繁殖系数高、生长周期短,可在短时间内繁殖出大量生长一致的组培苗,还可进行品种的脱毒、复壮、种质资源保存,保持品种特性。培养条件既可人为控制,管理方便,又可摆脱自然地理环境和季节的限制,有利于工厂化生产和自动化控制等。利用组织培养技术,还能解决因长期采用扦插和分株繁殖导致的种性退化、产量下降等问题。

2 材料与方法

2.1 试验材料

采用锦绣川景区菊花养殖基地春季新生长出的“粉十八”嫩茎作为外植体进行试验,属于植物器官培养。春季是植物生长发育的黄金季节,取幼龄生长健壮的外植体更容易诱导成功。在晴朗天气采集可减小外植体消毒难度,最大程度减少外植体污染,有利于建立无菌体系,外植体采集后应尽快处理,放置过久生物活性会下降。从植物体上切割分离下来用以无菌培养的部分称为外植体,外植体是用于组培快繁的初代接种材料,包括植物细胞、器官、组织或原生质体[1]。外植体的选择是组织培养试验重要的基础性环节,对建立无菌体系及能否成功诱导出愈伤组织或不定芽起着重要作用。选择时需考虑植物品种、年龄及生长状态等多方面因素,通常选用易于消毒、代谢旺盛、有较强再生能力的组织或器官作为外植体[2]。

2.2 试验方法与设计

2.2.1 不同灭菌处理对外植体的影响。将采集到的“粉十八”顶端幼嫩茎段于清水冲洗30min,剪去叶片,放置于超净工作台,用70%~75%的酒精消毒10s。酒精穿透力强,对植物细胞具有较大杀伤力,幼嫩的植物器官应合理控制消毒时间,消毒后立即放入灭菌剂进一步消毒。0.1%升汞溶液,分别处理3min、5min、8min;2%次氯酸钠溶液,分别处理8min、10min、15min;10%次氯酸钠溶液,分别处理5min、7min、10min。为使灭菌剂更好地浸润外植体,在灭菌剂中添加几滴0.1%吐温-80,消毒期间轻轻晃动盛放消毒液和外植体的器皿,使消毒液与植物材料充分接触。

2.2.2 接种。外植体经过处理后,在无菌条件下放置于培养基上的过程称为接种。外植体消毒处理后,用无菌水冲洗4~6 次,直至无菌水中不见泡沫。无菌滤纸吸干水分后切成1cm 的茎尖和茎段,用消毒后的镊子夹住,垂直插入启动培养基,茎段至少应携带1 个茎节,接种时插入深度不可淹没茎节。每个培养瓶最好只接1 个外植体,最多不超过3 个,避免相互污染。接种操作在超净工作台进行,外植体消毒后应立即接种于启动培养基,如若不能马上接种,应浸润于无菌水中,时间不宜过长。

2.2.3 不同激素浓度对外植体初代启动的影响。将“粉十八”外植体切成1~1.5cm 带芽茎段,接种于启动培养基,外植体不宜过大。启动培养基中添加6-BA(浓度分别 为2.0mg/L、1.0mg/L、0.5mg/L)、NAA(浓度分别为0.3mg/L、0.2mg/L、0.1mg/L)2 种激素,共9 种培养基。每种培养基接种30 个外植体,重复3 次,通过试验观察不同激素浓度和配比诱导外植体的效果。

2.2.4 不同激素浓度对继代培养的影响。“粉十八”茎段启动培养后得到无菌侧芽,但数量有限,需转移到新的培养基上继续培养,获得大量丛生芽,即继代培养,将启动培养得到的丛生芽切割成单个转接于继代培养基。无菌材料在适宜的环境和营养条件下,可通过调节激素浓度和不同类型激素的相对配比,人为控制增殖系数。继代培养基中添加不同浓度和配比的6-BA(浓度分别为2.0mg/L、1.0mg/L、0.5mg/L)和NAA(浓度分别为0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L)2 种激素,共9 种培养基,每种培养基接种30 个无菌芽,重复3 次,观察记录其增殖效果。

2.2.5 不同激素浓度对生根培养的影响。继代培养得到的丛生芽,转接于生根培养诱导生根。菊花容易生根,采用1/2 MS+NAA 0.02mg/L、1/2 MS+NAA 0.2mg/L 及不添加任何激素的MS 培养基3 种生根培养基,剪切生长健壮的丛生芽于生根培养基,7d 后观察其生根情况。

2.2.6 培养条件。试验获得的无菌瓶苗放置于无菌培养室进行培养,无菌培养室温度23~28℃,室内相对湿度70%~80%,人工补光,光照2000Lux,每天光照14h。

2.2.7 生根苗移栽。生根培养2 周后,挑选健壮的无菌苗进行移栽,根系长度不宜太长,以不在培养基中弯曲为宜。因无菌培养室与大田环境存在较大差异,为保证无菌苗在大田环境能够正常成活并生长,移栽前需炼苗。先在栽培场所封口炼苗7d,开盖继续炼苗3d,最后用镊子小心夹出生根苗,清洗根部培养基后,种植于添加种植基质的穴盘,放置20~30d,温室15~35℃,相对湿度达70%以上,待其成活并正常生长后定植于大田,正常养护。

3 结果与分析

3.1 不同灭菌剂浓度和灭菌时间对外植体消毒的影响

外植体消毒所使用的灭菌剂,既要起到灭菌作用,又不能伤害植物活性。由表1 可知,经0.1%升汞溶液处理的“粉十八”茎尖全部失活;茎段经升汞溶液处理5min、8min 后,均失去活性;茎段用0.1%升汞溶液处理3min 后,污染率为40%,浪费严重,达不到最佳灭菌效果。此外,升汞属于剧毒药剂,残留不易去除,对外植体活性具有杀伤力,且会对环境造成严重伤害。因此,本试验采用的幼嫩茎尖、茎段不宜采用升汞作灭菌剂处理。

表1 0.1%升汞溶液处理“粉十八”外植体污染率

由表2 可知,2%次氯酸钠对外植体活性杀伤力较小,但污染率高。处理外植体8min 污染率为100%;处理茎尖、茎段10min 外植体污染率分别为86.6%、80%;处理茎尖、茎段15min 外植体污染率分别为63.6%、50%。

表2 2%次氯酸钠溶液处理“粉十八”外植体污染率

次氯酸钠消毒液对外植体杀伤力小,残留少,适宜的浓度和时间也能起到良好的灭菌作用。由表3 可知,用10%次氯酸钠溶液处理茎段10min,污染率仅为6.7%。综合考虑,茎段经酒精短暂处理后,用10%次氯酸钠溶液消毒10min,是最佳的外植体消毒方法。

表3 10%次氯酸钠溶液处理“粉十八”外植体污染率

3.2 不同激素浓度对外植体初代启动的影响

外植体接种于启动培养基后,基部膨大形成愈伤组织,腋芽在激素的刺激下萌发,愈伤组织继续培养可长出绿色丛芽。由表4 可知,启动培养基中NAA 浓度超过0.2mg/L 时,外植体基部分化出较多愈伤组织,但芽诱导率低,无法诱导出健壮侧芽。当NAA 浓度为0.1mg/L,诱导出的侧芽长势健壮,生长速度快。但高浓度的6-BA会导致玻璃化,6-BA 浓度为2.0mg/L 时,普遍存在玻璃化现象。当培养基中激素浓度为 MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L 时,平均芽诱导率达到100%,且芽壮,颜色呈深绿色,生长速度快,适合作为“粉十八”启动培养基。

表4 不同激素浓度对外植体启动培养的影响

3.3 不同激素浓度对继代培养的影响

由表5 可知,当增殖培养基为MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L 和 MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L 时,增殖系数分别为5.83、4.2,转接后的无菌芽2 周后长出深绿色、健壮的丛生芽,4 周后即可达到重复转接或生根水平。当培养基中6-BA 浓度为1.0mg/L 时,叶片卷曲、生长缓慢,6-BA 浓度为2.0mg/L 时,叶片畸形,玻璃化现象较重。由此可知,6-BA 虽然可以促进芽的形成、侧芽的生长,但浓度过高不利于植物正常生长。如果生长素比例大,则不定芽生长健壮,而增殖系数较低,达不到快速繁殖的目的。如果只用细胞分裂素,植株增殖系数虽大,但组培苗较细弱,需加入生长素以促进茎生长,需要一个壮苗的过程[3]。只有将二者比例调整到适宜水平,才能使健壮的不定芽快速增殖。

表5 不同激素浓度对继代培养的影响

3.4 不同激素浓度对生根培养的影响

根据试验,生根培养基为 1/2MS+NAA 0.02mg/L,1/2MS+NAA 0.2mg/L 时,7d 后无菌瓶苗均长出1cm 的白色不定根,且瓶苗颜色深绿,长高趋势明显,茎部长粗,叶片更加肥厚,适宜作为“粉十八”无菌瓶苗生根诱导的培养基。菊花易生根,空白MS 培养基作为生根培养基也可长出根系。在空白培养基培养10d 开始长出白色不定根,但生长速度缓慢,无法达到壮苗目的。

3.5 移栽大田后成活率

生根苗经驯化后定植于大田,小苗生长健壮,叶色深绿,成活率可达95%。

4 结语

“粉十八”是菊花十八系列之一,花瓣少,基部白色筒状,花瓣自基部延伸开展变大,黄色花心外露,花为奶白色,上面有淡紫红色条纹或色晕,花瓣呈辐射状略下垂,花姿奇特优美,极具观赏价值。由于分枝较少,无法为扦插繁殖提供大量母本,因而繁殖成活率低。本研究采用组织培养的方式,在MS 培养基中添加6-BA、NAA 2 种激素,探索不同激素浓度和配比,对诱导侧芽、大量分化丛生芽的效果,并诱导生根、移栽驯化,试图通过组培打破季节限制,短时间内得到大量生长一致的幼苗。

试验成功的关键在于激素的浓度和配比,启动培养阶段的NAA 浓度过高,会诱导产生大量愈伤组织,但愈伤组织包裹住原有外植体,无法分化形成不定芽;而6-BA 浓度过高,又会引起玻璃化,不利于转接后的增殖。试验结果表明,启动阶段MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L 时,可诱导腋芽萌发,获得健壮的无菌芽,为后续继代培养提供无菌体系。

继代培养时,6-BA 浓度应比启动培养基低,有利于诱导形成大量丛生芽。6-BA 浓度过高既会引起玻璃化现象,又会导致叶片卷曲,甚至出现畸形,植株生长缓慢。试验发现,继代培养基中,激素浓度为启动培养基的一半时,可取得较好的诱导丛芽效果,即培养基为MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L 时,可诱导出健壮的丛芽,增殖系数也能满足生产需求。菊花易生根,为实现生根和壮苗双重效果,生根培养基可采用1/2MS+NAA 0.02mg/L,7d 左右就可诱导长出白色根系,且移栽后成活率高。

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