MDCK 细胞流感疫苗层析工艺的建立

杨越，李雪娇，郭骐源，郭丹丹，郭轩麟，吴业红

长春生物制品研究所有限责任公司，吉林 长春 130012

目前，大部分流感疫苗采用鸡胚工艺进行生产，该生产工艺成熟、可靠，但存在许多不可控因素，如疫苗毒株易变异、鸡胚质量差异大、生产过程质量控制难度高、劳动强度大，且产量受鸡胚供应限制［1-3］。因此，WHO 积极推荐各国发展以哺乳动物细胞作为基质的细胞流感疫苗代替鸡胚流感疫苗［3-4］。2007年，国外已有MDCK 细胞流感疫苗上市，临床应用结果显示，安全性与鸡胚流感疫苗相当，且有效性更具优势，特别是针对H3N2 毒株的保护力明显强于鸡胚流感疫苗［5-6］。

细胞流感疫苗需采用传代细胞系（如MDCK 细胞）作为生产基质，细胞本身具有成瘤性，因此，将残余宿主DNA 和蛋白含量降至最低是该疫苗下游纯化工艺的重点。鸡胚流感疫苗中常用的层析介质如分子筛Sepharose 4FF 对去除残余DNA 的效果较差［7］，因此，急需寻找新型层析介质用于细胞流感疫苗下游纯化工艺。亲和层析介质Cellufine Sulfate由70 μm 纤维素微珠以低浓度的硫酸酯为配体，能够特异性结合抗凝血酶Ⅲ、凝血因子、多种酶及多种病毒［8］。国外有文献报道，硫酸基团能特异性吸附流感病毒，可去除MDCK 细胞流感疫苗中99%的残留DNA 及69%的残留宿主蛋白［9］，国外企业已将该工艺应用于细胞流感疫苗的大规模商业化生产中。本研究以亲和层析介质Cellufine Sulfate 作为纯化介质，建立MDCK 细胞流感病毒的层析工艺，以期为细胞流感疫苗大规模纯化奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病毒液 MDCK 细胞流感病毒液（批号分别为：SGPBY202104、SGPBY202105、SGPBY202206）由长春生物制品研究所有限责任公司疫苗六室制备。

1.2 主要试剂及仪器 宿主细胞残留DNA 样本前处理试剂盒及MDCK 细胞DNA 残留量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）购自湖州申科生物技术有限公司；MDCK 宿主蛋白残留量检测试剂盒购自美国赛纳斯科技公司；抗原标准品（19 ／ 322）及抗体标准品（16 ／ 158）均购自英国 NIBSC；AKTA pure150 及Sepharose 4FF 层析介质均购自美国GE 公司；层析介质Cellufine Sulfate 购自日本JNC 公司；层析柱BXK16 ／ 20 及 50 ／ 1000 均购自博格隆生物技术有限公司。

1.3 亲和层析条件的优化

1.3.1 洗脱缓冲液盐浓度 用磷酸缓冲液平衡Cellufine Sulfate 层析柱5 ～8个柱体积，至紫外检测器归零后上样（共检测3 批MDCK 细胞流感病毒液，批号同 1.1 项），线性流速为 100 cm ／ h；磷酸缓冲液中分别添加不同浓度NaCl（0.5、1、1.5 mol／L）作为洗脱液进行目的蛋白洗脱，波长280 nm 紫外吸光值上升时开始收样，下降后结束收样，检测血凝素（hemagglatinin，HA）含量、宿主DNA 残留量和宿主蛋白残留量，并计算HA 回收率、宿主DNA 去除率及宿主蛋白去除率。用0.1 mol／L NaOH 以100 cm ／h 的流速冲洗2个柱体积，保存至0.01 mol／L 的NaOH 中。

1.3.2 线性流速 按1.3.1 项方法上样后，线性流速分别设为 50、100、150 cm ／ h，采用最佳盐浓度的磷酸缓冲液进行洗脱，其他检测步骤及检测项目同1.3.1 项。

1.3.3 样品浓缩倍数 将样品进行1、2 及5 倍超滤浓缩，采用最佳线性流速进行上样，最佳盐浓度的磷酸缓冲液进行洗脱，其他检测步骤及检测项目同1.3.1 项。

1.4 动态结合载量 按1.3.1 项方法连续上样40个柱体积，采用最佳盐浓度的平衡缓冲液及线性流速进行洗脱，流穿峰起峰后开始分段收集，检测HA含量，并按下式计算QB，10%的动态结合载量。

式中QB，10%为10%穿透水平下的动态结合载量（μg ／ mL），VA 为 10%穿透水平的进料体积（mL），C0 为进料中 HA 的含量（μg ／ mL），VC 为柱体积。

1.5 亲和层析优化条件的验证 采用最佳亲和层析条件纯化3 批细胞流感病毒液（SGPBY202104、SGPBY202105、SGPBY202206），检测项目同 1.3.1 项。

1.6 与其他层析介质的比较 Sepharose 4FF 柱体积1 800 mL，上样体积100 mL，上样缓冲液为平衡缓冲液 0.01 mol ／ L PBS（pH 7.4），上样流速为60 cm ／ h，280 nm 紫外吸光值开始上升时收样，下降后结束收样；亲和介质采用已确定的最佳条件，上样体积为100 mL，其他检测步骤同1.3.1 项。采用两种层析介质纯化细胞流感病毒液（SGPBY202105），检测项目同1.3.1 项。

1.7 纯化样品的检定

1.7.1 HA 含量 采用《中国药典》四部（2020 版）中的单向免疫扩散实验［10］。将抗原标准品与纯化样品分别加入含有抗体标准品的1.5%琼脂糖凝胶板上，20 ～ 25 ℃放置 18 h 以上；用 0.01 mol ／ L PBS 浸泡1 h；干燥、染色、脱色。以抗原标准品形成的沉淀环直径对其相应抗原浓度建立直线回归方程，代入供试品的沉淀环直径，计算HA 含量。

1.7.2 宿主DNA 残留量 采用宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒及MDCK 残留DNA 检测试剂盒检测纯化样品中的宿主DNA 残留量。

1.7.3 宿主蛋白残留量 采用MDCK 宿主蛋白残留量检测试剂盒检测纯化样品中的宿主蛋白残留量。

1.8 统计学分析 应用SPSS 26 软件进行统计学分析，数据均以均值 ± 标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析方法，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 最佳亲和层析条件

2.1.1 洗脱液盐浓度 随着洗脱液盐浓度的升高，纯化产物的宿主蛋白去除率呈上升趋势，但差异无统计学意义（F = 0.263，P = 0.797）；宿主 DNA 去除率变化较小，差异无统计学意义（F = 0.808，P =0.466）；HA 回收率则显著升高，差异有统计学意义（F = 5.291，P = 0.030）。见图 1 和表 1。因此，选择1.5 mol ／ L 为最佳洗脱液盐浓度。

图1 不同盐浓度洗脱液的层析图谱Fig.1 Chromatogram of purified virus eluted with eluent at different salt concentrations

表1 不同盐浓度洗脱液的纯化效果（%，，n = 3）Tab.1 Purification effects of virus eluted with eluent at different salt concentrations（%，，n = 3）

表1 不同盐浓度洗脱液的纯化效果（%，，n = 3）Tab.1 Purification effects of virus eluted with eluent at different salt concentrations（%，，n = 3）

盐离子浓度（mol ／ L）0.5 66.61 ± 10.61 99.93 ± 0.02 29.34 ± 2.82 1 67.39 ± 13.90 99.70 ± 0.25 52.87 ± 7.67 1.5 70.99 ± 15.39 99.80 ± 0.17 59.53 ± 12.28宿主蛋白去除率宿主DNA去除率 HA 回收率

2.1.2 线性流速 50、100、150 cm ／ h 3 种线性流速纯化产物的的宿主蛋白去除率、宿主DNA 去除率及HA 回收率差异均无统计学意义（F 分别为3.260、0.726、2.170，P 分别为 0.797、0.522、0.165），见图2 和表2。因此，选择HA 回收率最高的100 cm ／ h为亲和层析的最佳线性流速。

表2 不同线性流速的纯化效果（%，，n = 3）Tab.2 Purification effects of virus at different linear flow rates（%，，n = 3）

表2 不同线性流速的纯化效果（%，，n = 3）Tab.2 Purification effects of virus at different linear flow rates（%，，n = 3）

线性流速（cm ／ h）50 66.61 ± 10.61 99.83 ± 0.14 53.08 ± 2.38 100 67.39 ± 13.90 99.79 ± 0.30 64.24 ± 16.99 150 70.99 ± 15.39 99.95 ± 0.01 53.43 ± 0.34宿主蛋白去除率宿主DNA去除率 HA 回收率

图2 不同线性流速的层析图谱Fig.2 Chromatogram of purified virus at different linear flow rates

2.1.3 样品浓缩倍数 1、2、5 倍 3 种浓缩倍数纯化产物的宿主DNA 去除率差异无统计学意义（F =1.929，P = 0.195）；但随着浓缩倍数的升高，宿主蛋白去除率明显降低（F = 3.901，P = 0.032）；HA 回收率显著升高（F = 3.599，P = 0.046）。见图 3 和表 3。因此，确定样品的最佳浓缩倍数为5 倍。

图3 不同浓缩倍数的层析图谱Fig.3 Chromatogram effects of samples at different concentration folds

表3 不同浓缩倍数的纯化效果（%，，n = 3）Tab 3.Purification effects of samples at different concentration folds（%，，n = 3）

表3 不同浓缩倍数的纯化效果（%，，n = 3）Tab 3.Purification effects of samples at different concentration folds（%，，n = 3）

浓缩倍数 宿主蛋白去除率 宿主DNA 去除率 HA 回收率1 87.71 ± 7.75 99.20 ± 0.74 39.93 ± 21.93 2 83.14 ± 2.34 99.89 ± 0.03 72.67 ± 15.67 5 70.4 ± 16.91 99.75 ± 0.15 80.74 ± 34.34

2.2 动态结合载量 上样35个柱体积后流穿紫外值明显上升，此时HA 含量为56 μg／mL；上样至925 mL时发生10%穿透，亲和层析结合 HA 的 QB，10%为2 072 μg ／ mL 介质。见图 4。

图4 动态结合载量Fig.4 Dynamic binding capacity

2.3 亲和层析最佳条件的验证 3 批细胞流感病毒液在最佳条件下纯化后，宿主DNA 去除率均达99%以上，宿主蛋白质去除率达70%以上，HA 回收率达80%以上，该条件对杂质去除和HA 回收均较稳定，见表4。

表4 最佳层析条件验证（%）Tab 4.Verification of optimal condition for affinity chromatography（%）

2.4 与其他层析介质的比较 亲和层析Cellufine Sulfate 和分子筛Sepharose 4FF 纯化的宿主蛋白去除率分别为77.44%和87.04%，宿主DNA 去除率分别为97.35%和69.01%，HA 回收率分别为84.96%和55.59%。表明Sepharose 4FF 在宿主蛋白去除效果上有优势，亲和层析Cellufine Sulfate 在HA 回收和宿主DNA 去除效果更佳。

3 讨 论

由于层析的类型多样且分离效果理想，目前已成为生物制品生产及研究领域中的主要纯化方法。其中亲和层析和凝胶过滤层析又称分子筛层析和离子交换层析，是流感病毒的主要纯化方法［11］。细胞流感疫苗在生产过程中会产生许多影响制品效果和质量的杂质，从监管与安全的角度出发，一直以来，宿主残留蛋白质和宿主残留DNA 在内的宿主残余杂质受到格外关注［12-13］。因此，宿主蛋白和DNA 去除率是MDCK 细胞生产流感病毒的重要评价指标。

研究表明，凝胶过滤层析Sepharose 4FF 对细胞基质流感病毒液的杂质蛋白与宿主残留DNA 的去除率仅为65%和66%［14］；以两种基于甲基丙烯酸酯的强阴离子交换树脂GigaCap Q-650M 和NH2-750F 的离子交换层析对HA 回收率和宿主DNA 去除率不稳定，且无法实现两者同时获得较好的纯化效果［15-17］。本研究对亲和层析Cellufine Sulfate 纯化流感病毒的上样流速、洗脱液盐浓度及样品浓缩倍数进行了优化，确定最佳线性流速为100 cm ／ h，洗脱液最佳盐浓度为1.5 mol ／ L，最佳样品浓缩倍数为5倍。在最佳层析条件下，纯化流感病毒的宿主DNA去除率达99%以上，宿主蛋白去除率达80%以上，HA 回收率达70%以上，在确保HA 回收率较高的情况下，可同时获得较好的杂质去除效果，且亲和层析Cellufine Sulfate 的HA 回收和宿主DNA 去除效果更优于分子筛Sepharose 4FF。本实验为细胞流感疫苗的下游纯化研究提供了实验依据，为大规模生产细胞流感疫苗奠定了基础。