黑绒鳃金龟染色体核型研究

姜晓静伍和平曲春娟焦 坤曲明静任 艳*鞠 倩*

(1.山东省花生研究所,山东 青岛 266100;2.惠州海关综合技术中心,广东 惠州 516001)

黑绒鳃金龟(MaladeraorientalisMotschulsky)又名东方金龟子、天鹅绒金龟子,隶属于鞘翅目(Coleoptera)金龟甲总科(Scarabaeoidea)鳃金龟科(Melolonthidae),在东亚的中国、日本、朝鲜、蒙古和地处亚欧大陆的俄罗斯均有分布,其中以我国的东北和华北地区危害最为严重[1]。黑绒鳃金龟的寄主植物据统计高达149种,成虫主要危害杨树、柳树、榆树、刺槐、苹果、梨子、葡萄、桑树、向日葵等的叶片和幼芽,食性杂、食量大;它的幼虫又称为蛴螬,可取食萌发的林木种子,以及植物的根部和果实,如花生、大豆等作物,是重要的地下害虫,也是国内外公认的最难防治的土栖性害虫[2-3]。染色体是生物遗传物质的载体,伴随着基因组测序技术的发展,将害虫的染色体核型分析与基因组数据相结合开展研究,不仅对于加深了解物种遗传与进化具有十分重要的意义,而且为害虫防治提供了新思路和新方法。

昆虫是地球生物圈的重要成员,也是种类最多的生物类群,而鞘翅目是昆虫纲乃至动物界物种最丰富、分布最广的一个目。鞘翅目包括四个亚目:原鞘亚目(Archostemata)、菌食亚目(Myxophaga)、肉食亚目(Adaphaga)和多食亚目(Polyphaga)。国内对鞘翅目昆虫的染色体研究较少,主要是多食亚目的几个物种。杨致远等1989年报道了米象(Sitophilusoryzae)和玉米象(Sitophiluszeamais)的染色体数目均为2n=22[4];邵红光等1994年报道了新疆6种芫菁染色体核型,染色体数目2n=18~21,性别决定机制为XY或者XO型[5];陈斌等2005年报道了金龟总科码绢金龟50个精巢分裂中期细胞的85%细胞的染色体数目n=9[6];董原等2008年报道了蓼蓝齿胫叶甲的单倍染色体数目n=13+Xyp[7];刘平等2010年报道了松墨天牛(Monochamusalternatus)和光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)的染色体核型,它们的染色体数目均为2n=20,性别决定机制为XY[8]。国外对鞘翅目昆虫的染色体研究起步较早,已经有一百多年的时间,并且积累了很多物种的染色体核型数据。Yadav等于1979年总结了已发表的多食亚目的金龟总科的物种有209个,分布于16个科73个属,染色体个数2n=12、14、18、19、20、21、22、30,其中有160个物种的染色体个数是2n=20[9]。而Diogo等在2008年再次更新总结了金龟总科已发表染色体核型的物种大约有380个[10]。Sendogan等在2016年总结了已知染色体核型的多食亚目拟步甲科(Tenebrionidae)的物种超过250种,该科的大多数物种染色体数目也是2n=20[11]。Angus等在2021年的文章中总结了已知染色体核型的多食亚目水龟甲科(Hydrophilidae)的物种有95个,分布于33个属,染色体个数2n=18、20、22、24、26、28、30、32[12]。多食亚目的其他科如郭公甲科(Cleridae)、拟花莹科(Melyridae)、天牛科(Cerambycidae)以及吉丁虫科(Buprestidae)也有少数物种的染色体核型得到研究[13-14]。另外,肉食亚目的豉甲科(Gyrinidae)和龙虱科(Dytiscidae)的十几个物种的染色体核型也获得鉴定[15]。虽然已知染色体的物种数目有近千种,但与鞘翅目高达350 000个物种的数量比较还相差甚远,因此鞘翅目昆虫的核型分析研究显得迫在眉睫。

研究昆虫核型要选择细胞分裂旺盛的组织为材料,这样才易观察到合适的有丝分裂和减数分裂的染色体行为。昆虫的染色体研究所选用的材料有卵、精巢、卵巢、唾腺、马氏管、脑神经节等组织。一般来说双翅目昆虫取唾腺来观察染色体核型,也有蚊虫、果蝇、赤眼蜂、蚤类的染色体研究取幼虫的脑神经节来观察,而蚜虫取3~4龄有翅或无翅若虫胚胎观察染色体核型,绝大多数昆虫的染色体研究以精巢为材料。国内鞘翅目昆虫染色体研究主要用雄虫的精巢[4-5,7],国外则会用到卵、中肠以及精巢[16]。

本文用黑绒鳃金龟的成虫精巢来研究染色体核型,同时报道了一种制备时间短,步骤少,操作简单的鞘翅目昆虫染色体核型制备方法。

1 材料和方法

1.1 材 料

试虫采集及饲养:供试昆虫黑绒鳃金龟成虫于2021年6月上旬采集于山东省花生研究所莱西试验基地。采集的成虫雌雄分开,放在有透气孔的箱子中用新鲜的榆树叶喂养,保持箱内土壤的湿度。

试剂和仪器:秋水仙素(上海麦克林生化科技有限公司);卡宝品红染色液(北京酷来搏科技有限公司);粘附载玻片(江苏世泰实验器材有限公司);OLYMPUS SZ51体式显微镜和OLYMPUS BX53正置荧光显微镜、OLYMPUS DP74显微成像系统(奥林巴斯株式会社)。

1.2 方 法

1.2.1 染色体标本制备

前处理:将待处理昆虫黑绒鳃金龟雄性成虫洗净备用。虫体解剖:用昆虫针将黑绒鳃金龟固定在体式显微镜蜡盘内,加生理盐水(NaCl 6.8 g/L、CaCl20.2 g/L、KCl 0.2 g/L、MgCl2·6H2O 0.2 g/L、Na HCO30.15 g/L、葡萄糖7.7 g/L、蒸馏水1000 m L)至完全浸没虫体,用镊子和解剖剪刀从昆虫的腹部取出精巢组织。

标本制备包括5个步骤:① 秋水仙素处理:将解剖出的精巢置于0.05%的秋水仙素(生理盐水溶解秋水仙素粉末)处理30 min。② 低渗:秋水仙素处理后加入0.075 mol/L的KCl低渗处理20 min。③染色:用镊子取出精巢置于载玻片上,滴几滴卡宝品红染液染色28 min。④ 压片:用50%的冰醋酸分色后压片,用冰醋酸分色时尽量使背景染料颜色褪去,并用滤纸吸去多余染料和冰醋酸;在压片时盖玻片轻轻放下,避免与载玻片之间有过多气泡;盖上盖玻片后,双层滤纸盖在载玻片上,用食指按压,注意不要垂直按压,食指由左到右逐渐施力,不要使盖玻片移动。⑤ 镜检:将标本放在油镜下面,在正置荧光显微镜的40倍物镜下观察,找到处于分裂中期的细胞,选择染色体分散效果好且形态好的细胞在100倍物镜下拍照,镜台测微尺的单位是20μm。

1.2.2 染色体核型分析

用Photoshop图像软件进行核型分析,计算每条染色体的实际长度、相对长度、臂比值和着丝粒指数。染色体实际长度的测量使用软件标尺工具,依次打开:图像—分析—设置测量比例,根据照片中的标准刻度,设置合适的测量比例,量取染色体的实际长度,计算所需数据。染色体实际长度随染色体收缩程度不同而有显著变化,对同一种生物的染色体绝对长度,各人所测结果往往差异较大,故多用相对长度。

按照Levan等的标准进行染色体核型分析(表1),通过臂比值和着丝粒指数判断染色体的类型[17],最后确定黑绒鳃金龟核型公式。

表1 染色体分类标准Table 1 Chromosome classification criteria

2 结果与分析

2.1 黑绒鳃金龟染色体数目及性别决定机制

从镜检的细胞中可观察到黑绒鳃金龟染色体行为的3个不同时期:减数分裂的粗线期、中期Ⅰ、中期Ⅱ(图1)。选取染色体分散良好、结构完整、形态清晰的减数分裂中期Ⅰ分裂相的精母细胞进行观察统计。在减数分裂中期Ⅰ这个时期,两个同源染色体形成的二价体进行最大的浓缩并缩短(图2)。从精巢中找到10条二价体的细胞总数有30个,二价体数目少于10的细胞所占比例极小,可能是制片的过程中由外因引起的个别染色体丢失。得出黑绒鳃金龟染色体数2n=20。同时可明显观察到减数分裂中期Ⅰ性染色体X相对大于呈点状的性染色体Y,二者构成典型的“降落伞状二价体”结构Xyp(图2)。

图1 黑绒鳃金龟精母细胞减数分裂不同时期的染色体形态Fig.1 Meiosis of M.orientalis from testis

图2 黑绒鳃金龟精母细胞减数分裂中期Ⅰ分裂相Fig.2 The spermatogonial metaphaseⅠchromosomes of M.orientalis

综上所述,黑绒鳃金龟的双倍染色体组成为2n=20(9+Xyp),性别决定机制为Xyp型。

2.2 黑绒鳃金龟染色体核型

通过对黑绒鳃金龟精母细胞减数分裂中期Ⅰ和Ⅱ分裂相进行镜检,并统计染色体的相对长度、臂比值和染色体类型(图3,表2)。结果显示,黑绒鳃金龟的常染色体相对长度为6.88~12.88,X染色体的相对长度为6.22±0.14,Y染色体的相对长度为2.85±0.13,Y染色体最小。7号和9号染色体的臂比值分别为2.24、1.70,着丝粒指数分别为30.86、37.04,在25.00~37.50之间,为亚中部着丝粒染色体;Y染色体为端部着丝粒染色体;其他染色体着丝粒指数为43.29~49.75,在37.50~50.00之间,均属于中部着丝粒染色体。因此,黑绒鳃金龟的核型为2n=16m+4sm(♀),2n=15m+4sm+t(♂)。

表2 黑绒鳃金龟的染色体相对长度、臂比值和着丝粒指数Table 2 The relative length and arm ratio of chromosomes of M.orientalis

图3 黑绒鳃金龟精母细胞减数分裂中期Ⅰ和Ⅱ分裂相及核型Fig.3 The chromosomal metaphase and karyotypes of M.orientalis

3 讨 论

在鞘翅目昆虫中,目前报道的绝大部分物种的染色体数目为2n=20,因此这一染色体数目被称为甲虫的“典型数目”。本文研究的黑绒鳃金龟染色体,二倍体数目为2n=20,与鞘翅目昆虫的“典型数目”一致。同时,黑绒鳃金龟的性染色体X、Y在减数分裂中期Ⅰ形成“降落伞状二价体”,性别决定机制为Xyp,这也符合甲虫性别决定机制的特点(其他目昆虫很少或者完全没有Xyp的性别决定机制),属于鞘翅目昆虫祖先保留下来的一种古老染色体特征[18-19]。甲虫性染色体在减数分裂中期Ⅰ形成的Xyp二价体,对于减数分裂后期Ⅰ发生的性染色体正确分离有重要作用[20]。

目前,国外对鳃金龟科甲虫染色体核型的研究涉及的物种有40多种,绝大部分物种的染色体数目是20个,性别决定机制为Xyp,也有个别物种的性别决定机制是XO型[9,21-23]。本文的黑绒鳃金龟染色体核型研究是国内首次关于鳃金龟科物种的报道。

用于鞘翅目昆虫染色体核型制片的常见组织类型有卵、中肠、脑、卵巢和精巢等,其中脑适用于幼虫染色体制备[8,16]。本实验选取雄性成虫的精巢,每个精巢由六个精巢管组成,相互分开游离在腹节背隔之下,比较容易解剖,相比其他组织更容易获得。同时,我们也做了脑和卵的染色体制备,找到的分裂相细胞数目较少,而精巢染色体制备获得清晰的分裂相细胞数目更多。另外,本文未使用离心机分离精巢细胞,降低了实验对仪器的依赖性,避免了离心操作对细胞的影响,提高了制备核型玻片标本的成功率。本研究的黑绒鳃金龟染色体核型制备步骤包括:取材、预处理、低渗、染色、压片,整个过程仅需要大约1.5 h,是一种取材容易,制备时间短,制备步骤少,操作简单的染色体核型确定方法(图4)。精巢组织也没有经过匀浆离心,直接通过压片处理获得完整的染色细胞。在压片时盖玻片轻轻放下,避免与载玻片之间有过多气泡。盖上盖玻片后,双层滤纸盖在载玻片上,用食指按压,注意不要垂直按压,食指由左到右逐渐施力,也不要使盖玻片移动。我们使用该方法也鉴定了一种丽金龟以及其他两种鳃金龟物种的染色体核型(数据未发表)。固定是借助理化方法迅速将组织细胞杀死,并尽量保持其形态结构及内含物的真实状态。传统的吉姆萨染色固定液最好现配现用,长时间放置影响固定效果,且固定时间过长,一般为15~1 440 min[7-8]。动物细胞没有细胞壁因而更容易处理,使用的卡宝品红染色液的成分中含有酒精,酒精也可以起到固定作用,因此实验过程中低渗处理后直接进行染色,无需固定,简化了实验程序,使步骤更简单、方便,且节省时间。

图4 黑绒鳃金龟染色体核型制备步骤Fig.4 The karyotype and chromosome preparation steps of M.orientali

随着基因组学的发展,生物染色体核型分析也越来越有必要。染色体研究对了解生物的遗传变异、性别决定、个体发育和生理过程的调控等方面有重要意义,能为确定生物类群的地位、阐明物种的历史及其演化提供重要的依据,对解决近缘种之间的分类问题亦有作用。本文通过对黑绒鳃金龟染色体的相对长度、着丝粒指数、臂比值等核型指数的分析,确定了黑绒鳃金龟的核型特征,为进一步的细胞遗传学研究提供了一定基础。同时,我们在实验过程中摸索建立了一种更为简单快速的金龟子染色体核型制备方法,方便了更多的鞘翅目物种进行染色体核型鉴定研究。