花生AhMAPK 14基因的克隆及表达分析研究

朱立飞张初署唐月异陈 娜潘丽娟迟晓元张建成王 通王 冕

(山东省花生研究所/农业农村部花生生物学与遗传育种重点实验室/山东省花生重点实验室,山东 青岛 266100)

植物在生长发育过程中会面临多种胁迫,为了应对这些胁迫刺激,维持正常生命活动,植物经过长期进化形成了一套复杂的调控机制。其中,丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)级联途径是真核生物中普遍存在的一类较保守的丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶,在感知上游信号和响应逆境胁迫中起分子开关的作用,是植物体内重要的防御反应机制[1-3]。

MAPK通路一般由三种激酶组成,分别为MAP3K(MAPKKK)、MAP2K(MAPKK)和MAPK,这三种激酶形成MAPK级联的基本模式MAPKKK-MKK-MAPK,其中MAPKKK磷酸化并激活MKK,激活的MKK磷酸化并激活MAPK[4]。MAPKs通常存在于细胞质和细胞核中,参与植物的细胞分裂、生长发育、激素信号传递、非生物胁迫与病原菌的防御等过程[5-7]。研究表明,在拟南芥中盐胁迫可以激活MKK2-MAPK3/MAPK6正调控通路,也可以激活MKK9-MAPK3/6负调控通路[8-9];此外,水稻中的 Os MAPK4、Os MAPK7、Os MAPK14,玉米的Zm MAPK3,棉花的Gh MAPK2和Gh MAPK16等在应对干旱胁迫过程中发挥着重要作用[10-15]。同时,也有报道证实在拟南芥、烟草、玉米、棉花等植物中,MAPK级联反应参与ABA、JA等多种激素的信号转导[16-17]。MAPK级联途径响应逆境胁迫的分子机制已在多种作物中报道,但其在花生中的作用机制却鲜有研究。

花生(ArachishypogaeaL.)是人类饮食中油脂和蛋白质的主要来源之一,在世界范围内广泛种植[18]。我国是世界上重要的花生生产大国和消费大国,也是花生贸易大国,花生产业在我国农业生产和社会生产中占据重要地位[19-20]。作为地上开花,地下结荚的植物,花生的生长发育很容易受到外界环境的影响[21]。近年来,由于气候多变,干旱洪涝频发,环境因素成为制约花生产业的重要影响因子。因此,如何提高花生在逆境胁迫下的适应能力已成为我们亟待解决的难题。目前国内外对花生胁迫的研究主要集中在花生病害相关数量性状基因定位(quantitative trait locus,QTL)挖掘及分子标记的开发等[22]。有关花生在抗逆分子机理方面的研究还处于起步阶段,与其他植物相比仍存在很大差距。

本研究以课题前期转录组测序结果为基础,筛选并克隆获得关键基因AhMAPK14并以此为研究对象,通过实时荧光定量PCR检测其在花生各个组织中的表达量,以及在各种胁迫处理诱导下的表达量。初步证明其在花生中MAPK级联途径参与应对生物及非生物胁迫的过程。这将有助于我们更好地了解花生响应逆境胁迫的分子机理,为提高花生逆境适应能力提供重要依据,同时也为选育花生抗性新品种提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料

供试品种为花育20号(ArachishypogaeaL.cultivar Huayu20),由山东省花生研究所育成并保存。

1.1.2 质粒与菌株

实验所用菌种均为实验室保存,PMD18-Tsimple、PMD19-T等克隆载体购于TaKaRa公司,载体pCAMBIA-1300于本实验室保存。

1.1.3 实验试剂

实验所用试剂及试剂盒分别购自Promega、Sigma、TaKaRa、天根、上海生工等公司。所用RNase、抗生素和普通化学试剂均为国产分析纯。

1.1.4 引 物

本研究取花育20号品种4叶期花生叶片提取RNA,反转录合成cDNA,作为基因克隆的模板,所用引物如表1所示。

表1 实验所需引物Table 1 Primers required for the experiment

1.2 方 法

1.2.1 序列分析及系统发育树的构建

在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站上传测序结果,利用BLAST工具进行基因序列的同源性查找;利用DNAMAN软件的Multiple Alignment对这些序列进行基因同源性比较,用 MEGA 7.0软件的Neighbour-Joining法构建系统发育树。

1.2.2 亚细胞定位

构建亚细胞定位载体35S::AhMAPK14-GFP,以35S::GFP为对照载体,通过农杆菌介导侵染3叶期本生烟叶片。培养2~5 d后取侵染叶片下表皮,于OLYMPUS FV300激光共聚焦显微镜(奥林巴斯,日本)下观察定位情况,OLYMPUS DP26数码相机(奥林巴斯,日本)拍照。

1.2.3 组织表达模式分析

花生组织表达模式分析采用的材料为花生4叶期幼苗的根、茎、叶,盛花期的花生植株花瓣,成熟期的鲜花生种子的子叶以及取自催芽露白时花生种子胚的下胚轴。

1.2.4 诱导表达模式分析

花生实验处理及取材方法参考自梁丹等花生MAPK13基因的克隆及表达分析研究[23]。

2 结果与分析

2.1 花生Ah MAPK 14基因的获得

根据前期转录组测序已知序列设计引物(K14-F和K14-R),以花生cDNA为模板,进行PCR扩增,得到长约1 100 bp的片段(图1-A)。之后利用编码区序列设计引物,与已知的通用引物相结合,通过RACE-PCR技术,扩增得到5’非编码区DNA片段和3’非编码区DNA片段,两端的片段约400 bp(图1-B)。将上述3个片段与T载体连接、转化DH5α,筛选转化菌,PCR扩增得到1 800 bp左右的基因全长片段(图1-C)。

图1 花生Ah MAPK 14基因的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of Ah MAPK 14 gene

2.2 Ah MAPK14的生物信息学分析

将克隆得到的基因序列与模式植物拟南芥作比对,发现与拟南芥中的AtMAPK14同源性较高,因此参照拟南芥将基因命名为AhMAPK14。花生全基因组测序后,通过BLAST工具检索氨基酸序列发现,Ah MAPK14与Ah MAPK7(Arachis hypogaeaL:XP_025691811.1)同源性高达99.18%,由此猜测,AhMAPK14基因可能是AhMAPK7基因。此外,蛋白质分子序列进化树结果显示,花生Ah MAPK14与Ah MAPK7的亲缘关系最近,并且Ah MAPK14与蔓花生Ad MAPK7的亲缘关系较其他植物更近(图2)。Ah MAPK14与许多物种的MAPK7蛋白序列同源性均在80%以上,说明Ah MAPK14在大多数物种中具有高度保守性。

图2 Ah MAPK14蛋白质序列进化树分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of Ah MAPK14 protein sequences

选取亲缘关系较近的几个物种的MAPK7与Ah MAPK14进行氨基酸序列比对分析,发现MAPK14含有11个MAPK蛋白家族典型的保守区域,1个特异性的N端A-Loop保守基序和TEY基序(图3)。MAPK家族的保守结构域是其参与植物防御反应的关键结构域,因此,我们推测Ah-MAPK14在花生抵御逆境胁迫过程中发挥作用。

图3 Ah MAPK14多序列比对分析Fig.3 Multiple sequence alignment analysis of Ah MAPK14

2.3 Ah MAPK14亚细胞定位

蛋白质的定位对其功能有重要影响。为进一步分析Ah MAPK14的功能,我们构建了Ah-MAPK14与GFP的融合载体35S::Ah-MAPK14-GFP,利用农杆菌介导转化烟草后,通过激光共聚焦显微镜观察GFP荧光分布情况。结果显示,Ah MAPK14定位于细胞核和细胞质中(图4),与之前报道的MAPK家族成员的定位一致,进一步说明Ah MAPK14在花生中的作用可能与其他植物中MAPKs成员相类似。

图4 Ah MAPK14亚细胞定位Fig.4 Subcellular localization of Ah MAPK14

2.4 Ah MAPK 14基因的组织表达模式分析

qRT-PCR检测结果显示,以子叶中的表达量为参照,AhMAPK14基因在花生的下胚轴和花中的相对表达量极高,在根、茎、叶中几乎不表达(图5)。AhMAPK14基因的表达具有一定的组织特异性,推测Ah MAPK14可能参与花生的胚轴发育和开花过程。

图5 Ah MAPK 14基因在花生不同组织中的表达量Fig.5 Expression of Ah MAPK 14 in different tissues of peanut

2.5 AhMAPK 14基因响应植物激素和信号分子诱导

MAPKs参与植物激素信号途径已在多种植物中被报道。我们用不同浓度的激素对花生幼苗进行处理,通过检测发现,当受到ABA刺激后,AhMAPK14基因的表达量随着时间推移呈逐渐上升,说明ABA处理能诱导AhMAPK14的表达;用乙烯处理后,AhMAPK14的表达量在短时间内明显下降,之后逐渐回升;用GA处理后,AhMAPK14表达量的变化趋势与用乙烯处理时相类似,说明乙烯和GA会抑制AhMAPK14的表达;SA处理后,AhMAPK14的表达量在短时间内没有明显变化,待48 h后才明显升高;在受到JA和H2O2的刺激后,AhMAPK14的表达量显著升高,并且上调倍数能达到10倍以上,这一结果表明JA和H2O2处理对AhMAPK14的表达影响较大。

图6 不同植物激素和信号分子诱导Ah MAPK 14的表达分析Fig.6 Expression analysis on Ah MAPK 14 induced by different plant hormones and signal molecules

综上所述,AhMAPK14能响应多种植物激素信号,且大多数植物激素能上调AhMAPK14的表达,仅有少数会起到抑制作用。同时,这些结果也表明MAPKs在花生中也能参与植物激素和信号分子传导途径。

2.6 非生物胁迫诱导Ah MAPK 14基因的表达

对花生幼苗分别进行低温、干旱及盐胁迫处理时,AhMAPK14的表达量均出现不同程度的上调。其中低温处理时,AhMAPK14的响应比较缓慢;干旱处理时,随时间推移,AhMAPK14的表达量呈先下降后上升之后逐渐降低的趋势;NaCl处理时,AhMAPK14的表达量在短时间内上升较为显著。以上表明,在花生中MAPK14的表达受干旱、低温以及盐胁迫的影响,且该影响可能具有时间上的特异性。因此,我们推测AhMAPK14基因参与花生抵御非生物胁迫的过程。

图7 Ah MAPK 14基因在非生物胁迫下的表达分析Fig.7 Expression analysis on Ah MAPK 14 under abiotic stresses

3 讨论与结论

目前已经从植物中成功分离到了很多MAPK,例如拟南芥、棉花、水稻、杨树、玉米中分别有20、28、17、21、21个 MAPK[24-28]。 有研究表明,在拟南芥中已经克隆得到的20个MAPK家族基因被证明参与到植物生长的各个方面。拟南芥作为一种典型的模式植物,其基因组已实现全序列分析。本研究将克隆得到的基因与拟南芥进行序列比对,发现其与拟南芥中的At MAPK14同源性最高,因此将其命名为AhMAPK14。随着花生基因功能注释的逐渐完善,我们通过BLAST工具检索发现,MAPK14蛋白与栽培种花生中MAPK7蛋白同源性极高,与野生型及蔓花生(花生祖先A.duranensis)中MAPK7的同源性也高达90%以上,与其他植物中的MAPK7蛋白同源性也非常高。由于花生种质资源较多,品种之间存在一定的差异性,因此我们猜测AhMAPK14基因就是花生中的AhMAPK7基因。

MAPKs存在于细胞质和细胞核中,参与不同的细胞生理过程,包括生长、发育和应激反应等[29]。本研究通过亚细胞定位发现Ah MAPK14定位于细胞质和细胞核中,这一结果也表明在花生中Ah MAPK14与其他MAPK家族成员发挥的功能可能具有相似性。此外,我们通过分析其组织表达模式发现AhMAPK14主要在花和下胚轴中表达,说明其可能主要在花和下胚轴中发挥作用,是否参与下胚轴的发育以及开花过程还有待进一步实验研究。

在植物中,MAPKs在环境信号和发育信号的转导中起着重要作用。通过调节MAPK级联反应,细胞能够对由高低温、紫外线辐射、臭氧、活性氧、干旱、高低渗透压、重金属、伤害和病原体感染等引起的一系列胁迫作出反应[30-31]。此外,生长素(AUX)、脱落酸(ABA)、茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)、乙烯(ET)、油菜素内酯(BR)和赤霉素(GA)等激素也能通过MAPK级联作用影响信号传导[32-33]。我们通过实验发现干旱、低温、高盐胁迫以及ABA、JA、SA、H2O2等激素或信号分子能诱导AhMAPK14的表达,与其他植物中的MAPKs表现相一致,表明MAPKs可能在不同物种之间具有相同的功能。之前有研究发现,在大白菜中,BraMAPK17-2和BraMAPK19-1的表达被GA3上调,而像BraMAPK3、BraMAPK10-2/3、BraMAPK10-4/5、BraMAPK5、BraMAPK13、BraMAPK1、BraMAPK7-1、BraMAPK7-2、Bra-MAPK8-1和BraMAPK16-2等多数BraMAPKs的表达量在GA3处理后显著降低[34]。我们的实验结果显示GA及ET抑制AhMAPK14的表达,其响应GA的作用机理可能与白菜中有相似之处。MAPKs响应信号分子的作用机制是复杂的,关于Ah MAPK14参与花生信号通路的证据还需要进一步的实验研究。

我们通过生物信息学分析、亚细胞定位、组织特异性表达分析、激素诱导表达分析等实验证明,Ah MAPK14具有MAPK家族的共有特征,并且AhMAPK14基因的表达水平受非生物胁迫和多数植物激素的诱导,初步表明Ah MAPK14在花生中参与逆境胁迫过程与植物激素和信号分子传导途径。MAPKs参与花生中信号传导和抵御非生物胁迫过程的具体作用机制尚不明确。下一步研究将继续以Ah MAPK14作为切入点,详细解析Ah MAPK14在花生防御非生物胁迫过程中的作用机制,为选育花生抗性品种提供新思路。