运动对小型猪肢体荧光素钠循经迁移影响的初步观察

2022-08-15熊枫贾术永宋晓晶王广军王淑友李宏彦王瑾玉张维波

中国运动医学杂志 2022年6期

熊枫贾术永宋晓晶王广军王淑友李宏彦，3 王瑾玉张维波

1 中国中医科学院针灸研究所（北京 100700）

2 北京中医药大学针灸推拿学院（北京 100029）

3 中国中医药科技发展中心（国家中医药管理局人才交流中心）（北京 100027）

生命在于运动，《素问·上古天真论》指出：“余闻上古有真人者，提挈天地，把握阴阳，呼吸精气，独立守神，肌肉若一”，强调中医养生要锻炼身体，使筋骨肌肉的活动高度协调。运动养生有多种形式，跑步是西方式运动锻炼的一种普遍形式，而东方的太极拳、八段锦等缓慢运动甚至几乎不动的站桩、瑜伽等也具有显著的养生作用。不同运动对机体产生有益作用的差异和机制是什么？Litscher与张维波等曾初步比较了慢跑与打太极拳的心率变化，发现两者的心率都有所增加，而慢跑者的平均心率更快，其心率变异性也有所不同[1]。

《灵枢·经脉》讲：“经脉者，所以能决死生，处百病，调虚实，不可不通也。”认为经络通畅是维持生命健康的基本条件。张维波根据组织液流动的达西定律和连续性方程，推测经脉具有低流阻特性，存在组织液向经脉的汇聚和沿经脉的流动[2]；使用生物力学方法证明了经脉的低流阻特性以及较低的组织液压[3-5]，在人和小型猪上发现了循经低流阻通道[2]。随后，该团队使用阿尔新蓝染料在透明鱼上发现了类经脉的迁移轨迹[6-7]，又使用荧光素钠（sodium fluorescein，SF）和荧光照相法在大鼠任脉以及小型猪上发现了循经迁移轨迹[8-9]，最新的研究在人体穴位上注射SF，发现了循经的SF迁移轨迹[10]。一系列实验证明，经络是存在于间质中、具有低流阻特性的组织液通道，简称为“间质通道”，该学说可称为经络的间质通道学说。

20世纪80年代，刘亦鸣等[11]发明了基于低频脉冲阻抗测量原理的经络定位仪，祝总骧等[12]用该仪器发现了与古典经脉线基本重合的循经低电阻点（low im⁃pedance point，LIP）。90年代，穆祥等[13]用该仪器在小型猪上测出了循经低电阻线（low impedance line along meridians，LILM），该测量逐渐成为动物经络定位普遍使用的方法。笔者前期已在麻醉的小型猪四肢上观察到SF循经迁移的现象，但麻醉状态下小型猪的肢体完全不动，会影响淋巴管的自发收缩[14]，在麻醉浓度下的戊巴比妥钠和氟烷会导致动物胸导管淋巴流量的减少，有时可能还会使毛细血管滤出量减少[15]；而在运动情况下，不管是主动运动还是被动运动，腿部的淋巴流是增加的[16-18]，间接说明了间质中组织液量的增加。为了进一步验证运动对循经间质通道中组织液流动的影响，我们进行了如下实验：

1 材料与方法

1.1 实验动物、饲养方法及分组

选用中国实验用巴马猪（北京市琉璃河科兴实验动物养殖中心）4 只（雄性2 只，雌性2 只），体重11 ±2 kg，实验动物使用许可证号SCXK（京）2017-0003。每日提供浓缩饲料（希望饲料有限公司）：8:00 给料150 g，20:00给料100 g，饮水不限量，单笼饲养。动物房温度20℃± 2℃，湿度50% ± 10%Rh。整个实验获中国中医科学院针灸研究所伦理委员会批准。小型猪进行麻醉（麻醉组）、清醒原地运动（原地组）和清醒节律运动（节律组）三种状态的同体比较（示踪剂注射部位相同）。为方便在清醒状态下注射，本实验选取前肢外侧中部的LILM 与后肢外侧中部的LILM 为观察部位。每只小猪的LILM 左右肢对称各1 例，故每组含4只小猪共8例肢体LILM；后肢外侧1例因1只小猪注射时挣扎，针头脱出试剂污染皮肤表面不便观察，故后肢外侧每组7例。

1.2 主要仪器及试剂

3%戊巴比妥钠（德国分装，含量>99%），速眠新Ⅱ（吉林省华牧动物保健品有限公司），荧光素钠（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），宠物跑步机C400WS（武义宇晟运动器械有限公司），WQ6F30 经络定位仪（北京海淀区东华电子仪器厂），5D Mark2 相机（日本Canon），MC UV 77 mm 窄带滤色镜（日本kenko），600EX Ⅱ-RT 闪光灯（日本Canon），Filmer 600S LED灯（上海Starison），滤色纸（春兴牌彩色灯光滤色片），玉兔听诊器（上海医疗器械有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 麻醉与循经低电阻线的测定

使用3%的戊巴比妥钠溶液（0.5 ml/kg）和速眠新Ⅱ（0.1 ml/kg）分别注射小型猪两侧臀部肌肉进行麻醉。用电推剪去毛，暴露四肢部皮肤，有脏污处用75%的酒精棉球擦干净、晾干。使用经络定位仪在小型猪四肢外侧进行LIP的定位，前肢从腕部到臂部沿四肢长轴间隔约1 cm 依次扫描，后肢从跖部到大腿部扫描，用彩笔给予标记，这些点的连线称为LILM[13]。

1.3.2 示踪剂的注射

在小型猪清醒状态下，由一人抱起小型猪，然后选取LILM 在腕踝部的一点作为注射点（节律组和原地组），用记号笔标记，另一人用1 ml注射器垂直于皮肤表面刺入，深度3 mm，然后缓慢推注5%的SF 溶液0.4 ml；在小型猪麻醉情况下在相同标记的注射点（麻醉对照组）用相同的注射手法在相同深度注射相同剂量的SF溶液作为对照。

1.3.3 小型猪麻醉、清醒原地运动和清醒节律运动三种状态下的处置

小型猪注射SF 溶液，原地组在注射SF 后，将小型猪放置于特制的猪笼中，小型猪在笼中有一定的自由活动空间，存在轻微的原地运动。注射后50 分钟时，将小型猪麻醉后放置于试验台上准备拍照。节律组在注射SF后，将小型猪放置于动物跑步机上（图1），将跑步机参数设定为0.8 km/h。小型猪以此参数在跑步机上行走3分钟后，关闭机器，间歇休息1分钟；重复此操作2 次后，将跑步机参数设定为1.0 km/h，小型猪再以此参数行走3 分钟，关闭机器，间歇休息1 分钟。重复此操作2 次，结束运动。将小型猪麻醉后放置于实验台准备拍照。麻醉组注射SF后，在实验台上直接拍摄。3组均使用荧光照相法采集注射后60 min时的体表SF迁移轨迹图像。

图1 大型动物跑步机与小型猪运动图

1.3.4 成像环境

环境温度为25℃± 1℃，相对湿度30%～60%，室内外通风隔绝。在荧光剂注射及拍照过程中，室内无阳光照射、无灯光，保持暗室状态。

1.3.5 荧光照相法

小型猪放置于实验台上。在注射SF溶液后，使用Canon 5D2 数码相机采集SF 的体表迁移轨迹图像，镜头上安装窄带滤色镜。相机镜头垂直对准被观察部位，距离0.5～1 m，手动调节焦距和曝光量。采用闪光灯组（1 个主控闪光灯+1 个从属闪光灯）作为激发光源，主从闪光灯的灯头均加装蓝色滤光纸。主控闪光灯与从属闪光灯之间通过无线电传输进行同步闪光。覆盖有蓝色滤光纸的3 个LED 灯放置于观察部位周围，用于辅助激发SF 以及照相机取景和对焦时的照明。见图2。

图2 荧光照相装置示意图

1.4 观察指标

麻醉组分别在注射前和注射后2、5、10、15、20、30、40、50、60 min 时，对小型猪四肢注射点部位一带进行荧光照相，观察SF 体表迁移的动态轨迹；节律组待小型猪运动完并麻醉后，采集注射后60 min 时的荧光图像；原地组待小型猪被麻醉后，采集注射后60 min 时的荧光图像。测量60 min时前、后肢外侧SF体表迁移轨迹的长度。用听诊器分别测量三种状态下注射SF 20 min时的小型猪心率。

1.5 统计学方法

数据处理采用SPSS 22.0统计学软件进行分析，计量资料用平均数± 标准差（±s）表示。符合正态分布的数据采用方差齐性检验，方差齐时，采用单因素方差分析；若数据为非正态分布或方差不齐时，采用Kruskal-Wallis H 检验。以P<0.05 为差异有统计学意义的标准。

2 结果

2.1 小型猪在麻醉、原地运动、节律运动三种状态下的心率比较

三种状态下的心率结果如表1所示，原地组比麻醉组的心率显著升高（P<0.05），但升高幅度不大，其差异率的均值为18.31%（95%CI：13.02%，23.60%）。节律组比麻醉组的心率极显著升高（P<0.001），其差异率均值高达66.90%（95%CI：61.49%，72.31%）；节律组比原地组的心率极显著升高（P<0.001），其差异率均值为41.07%（95%CI：35.22%，46.92%）。参照人体有氧运动心率为最大心率的65%～85%之间，节律组的心率属于轻度有氧运动，原地组与麻醉组的心率都属于正常心率。

表1 小型猪三种状态下心率的比较（ ± s）

* P<0.05，*** P<0.001，与麻醉组比较；＃＃＃P<0.001，与原地组比较。

组别麻醉组原地组节律组例数8 8 8心率（bpm）71.00 ± 7.33 84.00 ± 12.28 *118.5 ± 9.3 ***＃＃＃

2.2 麻醉、原地运动、节律运动三种状态下荧光素钠迁移轨迹的比较

在小型猪前肢外侧中部LILM 的腕踝处注射SF 溶液后，原地组、节律组及麻醉组均可观察到以注射点为中心沿LILM方向出现的线状迁移轨迹，其迁移长度如表2 所示。结果表明，与麻醉组比较，原地组与节律组SF 迁移轨迹长度均极显著延长（P<0.001）。原地组与麻醉组的差异率均值为80.0%（95%CI：69.22%，90.64%），节律组与麻醉组的差异率均值为86.6%（95%CI：74.28%，98.97%）。原地组与节律组SF迁移轨迹的长度无显著性差异。测量小型猪前肢的平均长度（从腕横纹到腋横纹）为14.2 cm，麻醉组平均迁移长度占前肢长度的百分比为21.1%；节律组平均迁移长度占前肢长度的百分比39.2%；原地组平均迁移长度占前肢长度的百分比为37.9%。典型图像见图3。

表2 前肢外侧麻醉组、原地组与节律组SF迁移轨迹长度的比较（ ± s）

*** P<0.001，与麻醉组比较。

组别麻醉组原地组节律组例数8 8 8长度（cm）2.99 ± 0.61 5.38 ± 0.66 ***5.58 ± 0.94 ***

图3 小型猪前肢外侧麻醉、原地运动、节律运动三种状态下SF迁移轨迹图像

在后肢外侧中部LILM 的腕踝处注射SF 液后，麻醉状态下此处并未观察到SF线状迁移轨迹，但是在原地运动和节律运动情况下能观察到SF 轨迹有一定的迁移趋势（图4）。原地组与节律组SF迁移轨迹的长度无显著性差异。其迁移长度如表3所示。

表3 后肢外侧原地组、节律组与麻醉组迁移长度的比较（ ± s）

组别麻醉组原地组节律组例数7 7 7长度（cm）0（未能观测到线状迁移轨迹）2.65 ± 0.74 2.51 ± 0.61

图4 小型猪后肢外侧麻醉、原地运动、节律运动三种状态下SF迁移轨迹图像

3 讨论

观察外周组织中的组织液（interstitial fluid，ISF）流动情况尚无成熟的方法，李学义和王伟等[19]采用注射磁显葡胺于相对封闭的脑区，然后用磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）观察磁示踪剂信号随时间的衰减，间接推断组织液的流动。SF 与水有高度亲和，是理想的组织液示踪剂。本实验采用皮下注射SF，通过特定波长的激发光激发SF 发出荧光，再使用含窄带滤波的照相机显示SF在体表的流动特征，这种活体组织液可视化技术是组织液研究的一个方法学创新。本实验主要观测对象是肢体外侧的荧光迁移轨迹，主要原因是操作的限制，小型猪需在清醒状态下注射SF 溶液，受限于小型猪保定技术，只能注射在小型猪肢体外侧面。

本研究发现，在清醒状态下，无论是原地运动还是节律运动，SF 的迁移轨迹均比麻醉状态的轨迹明显延长，提示动物的麻醉状态对组织液的定向流动有抑制作用，其机制可能与麻醉状态下肌肉活动度降低以及呼吸的减弱有关。外周的组织液多存在于肌肉与肌肉或肌肉与皮肤的间隙中，肌肉的紧张收缩可导致间隙的变化，进而产生推动组织液流动的压力梯度。又因为动物在清醒站立时，肌肉除了产生维持姿势的等长收缩外，还会因原地走动而产生间歇的运动兴奋，形成脉冲式的压力波，推动组织液流动，而麻醉下的动物，不具备上述两种肌肉兴奋，故SF的迁移路线较短[20]。

动物在清醒情况下做节律性地跑步，虽然是在跑步机上，但可认为与实际的移动式跑步效果相当。因此，动物的肌肉特别是腿部的肌肉会出现节律性的收缩，产生推动组织液流动的动力，其SF 迁移轨迹长度显著长于麻醉组。但本研究发现，虽然节律组与原地组在心率变化上已经有了极显著的差异，表明节律组的肌肉活动强度应该远高于原地组，但是节律组的SF迁移轨迹长度并没有比原地组显著增加。此结果提示，组织液的长程定向流动并不完全取决于肌肉活动的强度，可能还与毛细血管滤出量、间质流阻甚至呼吸等多种因素有关，有待深入研究。

本研究还发现，原地组在与麻醉组的心率差异不大的情况下，SF迁移轨迹有极显著增加，而节律组的心率极显著高于原地组，但SF 的迁移长度却几乎相等，说明心脏“泵”的作用主要作用于脉管内的血液，对脉管外的组织液流动没有明显影响，心脏的节律性收缩不是组织液长程定向流动的主要动力。

另外在前期的实验中发现[9]，麻醉状态下的小型猪在其后肢外侧面体表难以观测到SF迁移轨迹，但本实验能观察到在运动后后肢外侧面SF 轨迹有迁移的趋势（图4），虽然没有典型的线状迁移，但是说明运动能在一定程度上促使后肢的SF轨迹迁移延长。

研究表明，肢体的主动和被动收缩或运动可以促进组织液的流动。让麻醉的狗做被动的蹬车运动，可以确切地观察到从后爪流出较多的并且是相对稳定的组织液[16]。对于肢体的主动收缩，骨骼肌的收缩可以对集合淋巴管产生一个直接的挤压效果。为了支持这一假说，Reed 等[17]观察到，将放射性标记的白蛋白注射到皮下或肌肉中，正常活动的清醒的大白鼠，其白蛋白清除率比麻醉状态下高3 到4 倍。白蛋白的清除率反映了白蛋白顺着组织液通道从组织间隙进入淋巴管，再通过淋巴循环被代谢掉的过程，清除率的提高对应局部淋巴流量的增加。这一增加可能反映了对淋巴流推动的一个刺激，但比起毛细血管净滤出液（组织液）的增加来说，它可能还是次要的，正如在皮肤和肌肉中标记的白蛋白从血浆到间质中的运输出现类似的增加那样[18]。与24 小时卧床相比，人在每天进行2 小时身体锻炼的情况下，同样可以使白蛋白在胫骨前皮肤的清除率增加20%[17]。这些均提示运动能促进组织液量的增加。本实验观察到的运动使SF 迁移轨迹延长的作用，也反过来说明运动可促使组织液流量的增加。

王伟等[21]观察到，大鼠运动后，其兴奋脑区的组织液流动加速，提示运动不仅可以促进运动肢体的组织液流动，还能对其它部位产生影响。整个人体的间质通道都富含流动的组织液，组织液的流动与人体的生理和病理状态显著相关。有研究显示，体外痛觉刺激及帕金森病、阿尔兹海默症等疾病均可导致组织液流动发生显著改变，流速减缓[22]。李宏彦等[23]观察到针刺补法可以促进局部组织液压升高，增加组织液向局部的汇聚，促进组织液的流动，达到补虚的作用。

运动是维护人体健康的主要方式之一。本研究发现，轻微原地运动和节律性运动与麻醉状态下的不运动相比，对四肢组织液的循经流动均有明显的促进作用，从经络健康和组织液流变学的角度说明了生命运动的重要性。但如何运动才能最好地促进健康？跑步是很多人采用的保健方式，其特点在于腿部肌肉以节律性等张收缩的方式拉动关节的屈张，进而形成推动身体水平运动的动力。由于肌肉长度发生了变化，力与力移动的距离相乘所代表的作功需通过心率和呼吸加快提供相应的能量，但其骨骼肌和心肌活动的加强可产生乳酸等代谢物，堵塞经络间质通道[24]。中国传统体育不太强调肌肉的节律性运动，太极拳和八段锦等传统体育多为原地的小范围慢速运动，运动频率和幅度远小于跑步，其肌肉的收缩方式多为维持姿势的等长收缩，需要的能量较少，产生的代谢废物也相应较少。本实验表明，这两种运动都可推动组织液定向流动，使SF 迁移加长，而原地运动的心率远低于节律运动，对保护心脏、减少代谢废物的形成更加有利。