基于网络药理学探讨参麦注射液治疗新型冠状病毒肺炎的作用机制▲

刘本涛 李本杰 袁彩英 陈 睿, 杜 秀 王 翔

(1 广西中医药大学药学院，广西南宁市 530001； 2 广西中医药大学赛恩斯新医药学院，广西南宁市 530222； 3 广西中医药大学第一附属医院药学部，广西南宁市 530023)

新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)是由新型冠状病毒感染引起的急性肺炎，临床表现为发热、干咳、气促、乏力等，严重者会出现呼吸困难、急性肺损伤、心肝肾功能衰竭、呼吸窘迫综合征、脓毒症休克等，严重者甚至死亡[1-2]。新型冠状病毒主要通过飞沫、亲密接触等途径传播，同时也存在气溶胶传播的可能[3-4]；其传染性强，传播速度快、范围广，且各类人群普遍易感，故严重危害人类健康和公共安全。

目前，临床上尚未研制出治疗COVID-19的特效药，但是基于中医药的对症和支持治疗在COVID-19的防控中发挥了重要作用，这充分显示了中医药的独特优势[5]。自疫情发生以来，国家卫生健康委员会推出并不断更新COVID-19的诊疗方案，第三版诊疗方案开始纳入中医治疗，第四版诊疗方案开始推荐使用中药注射液。在《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》[6]中，参麦注射液被推荐作为治疗危重型内闭外脱证患者的中成药。

参麦注射液由红参和麦冬两味药材组成，具有益气养阴、复脉固脱之功效。该药能明显地降低支原体肺炎和重症肺炎患者的炎症水平[7-8]，增强呼吸机相关性肺炎、脓毒症和肿瘤患者的免疫功能[9-11]，在疾病治疗和预后改善中发挥重要作用。上述作用也可能是其治疗COVID-19的潜在作用机制。本研究采用网络药理学方法筛选参麦注射液治疗COVID-19的活性成分和作用靶点，进一步探索参麦注射液治疗COVID-19的作用机制，以期为其用于治疗COVID-19提供更多的理论依据。

1 资料与方法

1.1 参麦注射液化学成分和靶点的搜集 利用中药系统药理学数据库及分析平台(http://tcmspw.com/tcmsp.php)和BATMAN-TCM数据库(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php)，针对参麦注射液中的主要成分红参和麦冬进行检索，同时结合相关文献[12-13]，获取参麦注射液的全部活性成分及其相关靶点，数据库未收录的活性成分则利用Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)在线预测其靶点。最后，对收集到的全部靶基因进行整理，并使用UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)校正基因名称。

1.2 参麦注射液治疗COVID-19的作用靶点的获取 在CTD数据库(http://ctdbase.org/)中以“coronavirus”“pneumonia”和“COVID-19”为关键词分别进行检索，搜集与COVID-19相关的靶点；利用在线平台Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)将上述疾病靶点与参麦注射液活性成分相关靶点进行取交集，筛选出的共同靶点即为参麦注射液治疗COVID-19的作用靶点。

1.3 活性成分-作用靶点网络的构建及分析 获取参麦注射液治疗COVID-19的作用靶点后，可进一步得到其对应的活性成分。将参麦注射液治疗COVID-19的作用靶点及其对应的活性成分导入Cytoscape 3.7.2软件，构建参麦注射液治疗COVID-19的活性成分-作用靶点网络，网络中节点代表成分或作用靶点，边代表成分与靶点的相互作用。最后通过软件的“Merge”功能将红参、麦冬的活性成分-靶点网络进行整合，并利用软件的“Network Analyzer”功能对整合网络进行网络拓扑学属性分析，获取活性成分和作用靶点的度值。

1.4 蛋白-蛋白相互作用分析 针对参麦注射液治疗COVID-19的作用靶点，采用STRING数据库(https://string-db.org/)进行蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)分析，物种限定为“Homo sapiens”，置信度设为>0.9，获取PPI网络。保存TSV格式的结果文件，从中获取节点1、节点2和结合分数的相关信息，将结果文件导入Cytoscape 3.7.2软件重新构建PPI网络并进行网络分析。计算网络中每个靶点的度值，以度值设置节点大小及颜色，度值越高，节点越大、对应颜色越深；边的粗细代表靶点间的作用强度，且与结合分数相关联，结合分数值越大、边越粗，靶点间相互作用越强。

1.5 功能和通路富集分析 将参麦注射液治疗COVID-19的作用靶点导入DAVID数据库(http://david.ncifcrf.gov/)中进行基因本体论(Gene Ontology,GO)功能富集分析和京都基因组与基因百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析，设定靶基因名称为“Homo sapiens”，阈值P<0.01，根据涉及靶点数目的多少筛选排名靠前的生物过程及通路，并采用ImageGP在线平台(www.ehbio.com/ImageGP/)对相关GO功能注释结果进行可视化分析。

1.6 靶点-通路网络的获取 将参麦注射液治疗COVID-19的作用靶点导入KEGG数据库(http://www.kegg.jp)，限定物种为人，通过KEGG Mapper工具的“Search Pathway”功能获取作用靶点涉及的相关通路并进行通路注释，最终得到作用靶点-通路网络。

2 结 果

2.1 参麦注射液的活性成分及相关靶点 共检索到参麦注射液活性成分112个，其中红参90个、麦冬22个，无共有成分；删除重复项并经UniProt数据库校正后共获取活性成分相关靶点807个，其中红参575个、麦冬427个，共有靶点195个。见图1。

2.2 参麦注射液治疗COVID-19的作用靶点 以“coronavirus”“pneumonia”和“COVID-19”为关键词，在CTD数据库中分别检索到6 918个、34 364个和472个相关靶点，共有靶点472个，作为COVID-19的靶基因；将上述472个疾病靶点与807个参麦注射液活性成分相关靶点进行取交集，得到148个共同靶点，即为参麦注射液治疗COVID-19的作用靶点。见图1。

图1 参麦注射液活性成分相关靶点(左图)及其治疗COVID-19的靶点(右图)的韦恩图

2.3 参麦注射液治疗COVID-19的活性成分-作用靶点网络构建 参麦注射液治疗COVID-19的148个作用靶点可对应到94个活性成分，其中有101个作用靶点对应红参的77个活性成分，有97个作用靶点对应麦冬的17个活性成分，二者共有作用靶点50个。运用Cytoscape 3.7.2软件构建参麦注射液治疗COVID-19的活性成分-作用靶点网络(见图2)，发现参麦注射液治疗COVID-19的活性成分主要包括皂苷、植物甾醇、高异黄酮、脂肪酸、多糖和挥发性成分，表明上述成分为参麦注射液在治疗COVID-19时发挥药效作用的物质基础。图中红参的活性成分-作用靶点网络包括179个节点(1味药材、77个活性成分、101个作用靶点)和649条边；麦冬的活性成分-作用靶点网络包括115个节点(1味药材、17个活性成分、97个作用靶点)和150条边。网络中同一活性成分可作用于不同靶点，同一靶点可对应多个成分，提示参麦注射液治疗COVID-19具有多成分、多靶点协同作用的特点。

图2 参麦注射液治疗COVID-19的活性成分-作用靶点网络

将红参、麦冬的活性成分-作用靶点网络整合后，利用“Network Analyzer”功能对整合网络进行分析，获取度值排名前25的活性成分及作用靶点，见表1。其中，薯蓣皂苷元、人参皂苷、三七皂苷、原人参三醇、人参炔三醇、β-榄香烯、豆甾醇等单一活性成分的度值较大，提示其可能为参麦注射液在治疗COVID-19时发挥药效的主要成分。前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、信号传导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、Na+/K+-ATP酶α1亚基(Na+/K+-ATPase alpha 1 subunit,ATP1A1)、纤维细胞生长因子1(fibroblast growth factor 1,FGF1)、热休克蛋白90α家族 A类成员1(heat shock protein 90 alpha family class A member 1,HSP90AA1)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、白细胞介素2(interleukin 2,IL-2)、B细胞淋巴瘤2(B cell lymphoma-2,BCL2)L1、雌激素受体1(estrogen receptor 1,ESR1)、溶质载体家族6成员4(solute carrier family 6 member 4,SLC6A4)、核受体共激活蛋白2(nuclear receptor coactivator 2,NCOA2)、细胞色素P450家族2亚家族C(cytochrome P450 family 2 subfamily C,CYP2C)19和CYP2C9等靶点分别与多个化学成分关联，表明它们可能是参麦注射液治疗COVID-19的重要作用靶点。

表1 参麦注射液治疗COVID-19度值排名前25的活性成分与靶点

2.4 参麦注射液治疗COVID-19的作用靶点的PPI网络 将筛选所得的参麦注射液治疗COVID-19的148个作用靶点导入STRING数据库，设置置信度>0.9，得到PPI网络；并将结果文件导入Cytoscape3.7.2软件中重新构建PPI，见图3。如图3所示，STAT3、MAPK1、MAPK3、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase,AKT)1、原癌基因Jun转录因子AP-1亚单位(Jun proto-oncogene,AP-1 transcription factor subunit,JUN)、肿瘤蛋白p53(tumor protein p53，TP53)、RELA、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、IL-6、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src(proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src,SRC)、Janus激酶(Janus kinase,JAK)、HSP90AA1、Caspase 8(CASP8)、VEGFA、EGFR等靶标蛋白在网络中十分突出(即节点大、颜色深)，提示以上靶点可能是参麦注射液治疗COVID-19的核心作用靶点。

图3 参麦注射液治疗COVID-19的作用靶点的PPI网络

2.5 GO功能富集和KEGG通路富集分析 将参麦注射液治疗COVID-19的148个作用靶点导入DAVID数据库进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析共映射到显著富集的GO 条目155个，包括生物过程120个、细胞组分15个和分子功能20个，采用ImageGP在线平台对上述3个模块中排名前10的条目进行可视化处理(见图4)。结果显示，生物过程主要涉及缺乏配体的外源性凋亡信号途径、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录正调控、DNA损伤的内源性凋亡信号途径、神经元凋亡过程、脂多糖介导的信号途径、凋亡过程负调控、宿主共生体生长负调控、DNA模板转录、胶原分解代谢过程等；细胞组分主要涉及细胞外间隙、胞液、细胞核、质膜外侧、核常染色质、黑素小体、膜筏、胞外基质、线粒体外膜、核仁等；分子功能主要涉及蛋白质异二聚活性、血红素结合、蛋白质均聚活性、ATP结合、生长因子活性、同一蛋白结合、药物结合、细胞因子活性、半胱氨酸型内肽酶活性、通道活性等。

图4 GO基因功能注释

KEGG通路富集分析共得到102个P<0.01的条目，取P值排名前30的通路绘制气泡图(见图5)。结果显示，参麦注射液治疗COVID-19的作用靶点主要涉及乙型肝炎、癌症信号通路、前列腺癌、弓形虫病、恰加斯病/南美锥虫病、癌症相关蛋白多糖信号通路、TNF信号通路、低氧诱导因子1(hypoxia inducible factor 1,HIF-1)信号通路、胰腺癌、磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/AKT信号通路、利什曼病、麻疹、小细胞肺癌、结核病、甲型流感等多条信号通路。

图5 KEGG通路富集分析

在GO基因功能注释和KEGG通路富集分析中，涉及到的靶基因主要包括TNF、PTGS2、STAT3、FGF1、HSP90AA1、VEGFA、IL-2、BCL2L1、基质金属蛋酶9、ESR1、SLC6A4、过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptor,PPAR)γ、细胞周期蛋白依赖性激酶4、NCOA2、CYP2C19、CYP2C9、MAPK1、MAPK3、AKT1、JUN、TP53、RELA、IL-6、PPARA、SRC、JAK、CASP8、EGFR等。

2.6 作用靶点-通路网络分析 将参麦注射液治疗COVID-19的148个作用靶点导入KEGG数据库，利用KEGG Mapper工具获取作用靶点涉及的相关通路并进行通路注释，最终得到作用靶点-通路网络，此网络可更加准确、直观地反映参麦注射液治疗COVID-19的分子作用机制。经数据库分析，得到多个靶点-通路相互作用关系网络，与病毒感染有关的通路包括人巨细胞病毒、甲型流感、麻疹、人乳头瘤病毒感染、丙型肝炎、疱疹、小细胞肺癌、人T细胞白血病病毒1型感染、乙型肝炎、结核等。其中仅丙型肝炎涉及的靶点和通路中就包括了18个参麦注射液治疗COVID-19的作用靶点(以红色标记)和相关信号通路(包括JAK-STAT、TNF、PI3K-AKT、MAPK、PPAR等信号通路)，见图6。

图6 丙肝病毒感染涉及的作用靶点-通路网络

3 讨 论

COVID-19属于中医“疫”病范畴，病因为感受“疫戾”之气，病位在肺。重症者多在发病1周后出现呼吸困难和/或低氧血症，严重者可进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒、凝血功能障碍、多器官功能衰竭等[6]。参麦注射液具有益气固脱、养阴生津的功效，临床上常用于治疗心力衰竭、休克、病毒性心肌炎、糖尿病等[12-14]，因此成为国家卫生健康委员会推荐的抗疫药物，用于危重型患者的治疗。本研究采用网络药理学方法共筛选出参麦注射液治疗COVID-19的作用靶点148个，可对应94个活性成分。活性成分中大部分属于人参皂苷、麦冬皂苷和植物甾醇。其中，人参皂苷能够解除机体免疫抑制，还具有心肌保护作用，可有效地改善心力衰竭患者的心功能[15-17]。麦冬皂苷可以提高心肌对缺氧的耐受性，并且降低心肌耗氧量，减轻缺氧对心肌的损伤[18]。豆甾醇和β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化、抗病毒、免疫调节、抗肿瘤和护肝等药理活性[19-20]。以上提示参麦注射液可能通过免疫调节和抗炎作用治疗COVID-19引起的炎症和肺损伤。

通过对参麦注射液治疗COVID-19的活性成分、作用靶点进行筛选，发现PTGS2、STAT3、FGF1、HSP90AA1、IL-2、BCL2L1等作用靶点的度值较高。研究显示，PTGS2/环氧合酶-2是一种诱导酶，其表达与肺炎和肺损伤有关，抑制PTGS2表达可减轻炎性损伤[21-22]；FGF1具有促进组织器官的形态发生、损伤修复、血管生成和神经细胞再生等作用[23]；STAT3、HSP90AA1和IL-2在调控肿瘤细胞增殖与凋亡中发挥重要作用[24-26]；BCL2可通过控制线粒体膜通透性来调节造血细胞和神经细胞的凋亡，其过度表达会减少脂质氧化物的生成[27]。此外，本研究PPI网络分析结果显示，MAPK1、MAPK3、AKT1、JUN、TP53、RELA、TNF、IL-6、JAK、CASP8、EGFR等是PPI网络中的核心靶点。MAPK家族在氧化应激、DNA损伤、癌症发展和病毒感染等刺激下被激活[28]。AKT1能够抗细胞凋亡，参与细胞凋亡和葡萄糖代谢等细胞过程[29]。JUN是核内原癌基因c-Jun的编码产物，c-Jun被各种细胞、炎症因子激活后，可促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力[30]。 抑制肿瘤坏死蛋白TP53的表达可减轻肺部炎症和上皮细胞凋亡[31]。RELA可促进中性粒细胞由循环系统进入肺组织，加重炎症反应。活化的中性粒细胞能够分泌γ-干扰素、IL-6等炎性因子，促进TNF-α等趋化因子的表达[32]。CASP8可抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭[33]。EGFR常表达于多种细胞的细胞膜上，病毒可利用EGFR介导的内吞作用或信号传导进入宿主细胞，并在细胞中复制，对抗宿主抗病毒反应[34]。由此可见，参麦注射液可能通过上述靶点在减轻机体炎症、促进心肺功能和提高免疫功能等方面发挥治疗作用。

GO功能富集分析显示，参麦注射液治疗COVID-19的作用靶点主要涉及与调控细胞凋亡和分解代谢等相关的生物过程。经KEGG富集到的通路涉及病毒和细菌感染、免疫调节、肿瘤和炎症等方面，其中以PI3K/AKT、TNF、HIF-1等信号通路最为重要。研究表明，PI3K/AKT信号通路参与细胞炎症反应的调控，PI3K抑制剂对病毒性肺炎小鼠肺组织炎症反应具有抑制作用；许多病毒能通过该通路来促使病毒蛋白表达、复制，并抑制宿主抗病毒反应[35-36]。TNF能直接杀伤肿瘤细胞且对正常细胞无明显毒性，并可促进促炎因子的表达，参与全身炎症反应[37]。HIF-1是一种转录因子，可作为氧稳态的主要调节剂，HIF-1通路与病毒性肺炎的炎症因子释放有关[38-39]。这表明参麦注射液可能通过上述通路抑制病毒和机体的炎性反应，从而发挥治疗COVID-19的作用。由作用靶点-通路网络分析结果可知，参麦注射液治疗COVID-19的分子作用机制涉及多条信号通路和相关靶点，作用机制复杂，这恰好与中医的整体观念和辨证论治相符合，从侧面显示出中医药在COVID-19的治疗中具有独特优势。

综上所述，参麦注射液的活性成分可能主要是可能通过作用于PTGS2、AKT1、JUN、TP53、RELA、EGFR等靶点，调控PI3K/AKT、TNF、HIF-1等信号通路来抑制新型冠状病毒和机体的炎症反应、调节细胞凋亡和机体免疫功能，从而达到治疗COVID-19的目的。但网络药理学存在一定局限性，还需进一步开展实验研究验证所得结论，从而为药物的临床应用提供更科学、有效的依据。