假单胞菌TCd-1对不同镉耐性水稻品种镉吸收及根际土壤酶活性与镉形态的影响*

柳玲林, 汪敦飞, 黄明田, 肖清铁, 2, 游 武, 钱 鑫, 郑新宇, 2, 林瑞余, 2**

(1. 福建农林大学生命科学学院/福建省农业生态过程与安全监控重点实验室 福州 350002; 2. 福建农林大学作物生态与分子生理学福建省高校重点实验室 福州 350002)

稻米镉污染严重威胁我国粮食安全, 镉污染土壤是稻米镉污染的重要来源。如何修复镉污染稻田已成为当前农业研究的热点问题。微生物修复是一种利用特定的微生物降低土壤中有害污染物活性或使污染物降解成无害物质的修复技术, 具有耗资少、操作简单且不会破坏土壤结构等优点, 被认为是最具应用前景的土壤修复技术之一。陆仲烟等发现伯克氏菌(sp.) D54能显著提高水稻()的耐镉能力, 降低水稻地上部镉含量。何小三等利用铜绿假单胞菌()菌剂进行水稻镉污染修复试验, 发现添加菌剂处理后水稻‘PI312777’根、茎鞘、叶镉含量分别显著降低17.2%～41.2%、1.4%～59.9%和31.1%～62.6%。Li等在镉污染土壤中接种耐镉芽孢杆菌() H3和根瘤菌() T1-17, 发现菌株通过降低镉的生物有效性使土壤水溶性镉降低79.0%～96.0%, 稻米镉含量降低45.0%～72.0%。汪敦飞等研究发现, 铜绿假单胞菌通过提高水稻根系活力、增强水稻光合作用和抗氧化酶活性, 促进了苗期水稻的生长。Wang等应用假单胞菌TCd-1处理镉污染下具有强化感作用的水稻‘PI312777’, 发现接种菌株后水稻根、茎、叶和糙米的镉含量均显著降低, 改变了土壤酶活性和镉的生物有效性。文欢欢等将假单胞菌TCd-1接种到10 mg∙kg镉处理的高镉耐性水稻‘特优671’和低镉耐性水稻‘百香139’中, 发现该菌通过提高水稻根系活力和光合作用, 促进了水稻的生长, 并显著降低分蘖期、抽穗期、成熟期水稻各部位的镉含量, 且不同镉耐性水稻品种间存在明显的差异。但假单胞菌TCd-1影响不同镉耐性水稻镉吸收及其根际过程的机理尚不清楚。为此, 本研究将从假单胞菌TCd-1菌株影响水稻根际土壤酶活性、镉生物有效性的角度, 阐明菌株降低不同镉耐性水稻镉吸收的根际微生态机制, 以期为其应用菌株修复镉污染水稻提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

高镉耐性水稻品种‘特优671’(TY)和低镉耐性水稻品种‘百香139’(BX)均为课题组前期从近年我国主栽的238份水稻品种中筛选得到。供试菌株假单胞菌TCd-1为课题组前期从水稻根际土壤筛选得到的耐镉菌株(专利号: CN103952333A)。菌悬液培养条件: 牛肉膏0.5%, 酵母粉1.0%, 氯化镁0.5%, pH 6.3, 温度33 ℃, 接菌量1.25%, 转速160 rpm, 培养24 h后用于接种。接种前取菌悬液100 mL在4 ℃、12 000 rpm下离心15 min, 去上清液, 菌株沉淀物用无菌水稀释至100 mL, 稀释后的菌液浓度测定为(5.33±0.24)×10cells∙mL。盆栽土壤取自福建农林大学水稻田, 基本理化性质为: pH 5.8, 全氮为0.31 g∙kg, 全磷为0.38 g∙kg, 全钾为0.46 g∙kg, 有机质为25.40 g∙kg, 总镉含量为0.18 mg∙kg。

1.2 水稻盆栽管理与取样

试验于2019年3−7月在福建农林大学生命科学学院温室中进行。在直径18 cm、高15 cm的塑料盆钵加入2.5 kg水稻土, 每盆施氮肥(以纯N计)375 mg、磷肥(以PO计) 250 mg和钾肥(以KO计) 250 mg。土壤镉处理采用氯化镉(AR), 镉处理浓度为10 mg∙kg(以纯镉计), 每周混匀搅动一次, 陈化4周后用于水稻栽培。在3叶1心期, 选择长势一致的水稻秧苗, 每盆移栽1株。待水稻返青后接种TCd-1菌株, 接种量20 mL∙kg(即每千克土壤接种20 mL稀释后的TCd-1菌液)。试验共设4个处理, 各处理3次重复: 1) CK: 不加镉且不接种菌株; 2) Cd: 加镉但不接种菌株; 3) CKB: 不加镉但接种菌株; 4) CdB: 加镉且接种菌株。

试验期间定期浇水, 保持浅水2～3 cm。在水稻成熟期取样, 取样时将水稻整株取出, 采用抖落法采集根际土壤, 置于室内自然风干, 过100目筛后用于酶活性及镉形态分析。收获的水稻洗净根部后将其分为根、地上部和籽粒3个部位, 分别置于烘干箱105 ℃杀青1 h后, 72 ℃烘干至恒重, 测定生物量。

1.3 根际土壤酶活性测定方法

参照《土壤酶及其研究法》, 测定土壤酸性磷酸酶(ACP)、脲酶(URE)、蔗糖酶(SUC)、纤维素酶(CUE)、过氧化氢酶(CAT)和多酚氧化酶(PPO)活性。

1.4 根际土壤镉形态与含量的测定

土壤镉形态提取方法参照Tessier等的5步连续提取法, 将土壤中的镉分为可交换态(exchangeable cadmium, EXC-Cd)、碳酸盐结合态(carbonate bound cadmium, Crab-Cd)、铁锰氧化物结合态(Fe-Mn oxides bound cadmium, FeMnO-Cd)、有机结合态(organic matter cadmium, OM-Cd)以及残渣态(residual cadmium, RES-Cd) 5 种形态, 各提取态经HClO-HNO消解、定容后用火焰原子吸收分光光度法测定镉含量。

1.5 水稻植株镉含量测定

将各部位植物干样磨成粉末状, 称取0.50 g置于硬质玻璃试管中, 采用HClO-HNO法消解样品, 消解液经0.22 μm滤膜过滤、定容后, 采用火焰原子吸收分光光度法测定镉含量。全株镉含量为各部位镉含量的加权平均值, 镉富集系数(BCF)=全株镉含量/土壤镉含量, 转移系数(TF)=地上部镉含量/根部镉含量, 镉富集量=各部位的镉含量×生物量。

1.6 数据处理与统计分析

采用Excel 2016和SPSS 25.0软件对数据进行统计分析。采用单因素(One-way ANOVA)和Duncan法进行方差分析和多重比较(=0.05), 用Pearson相关系数对水稻镉含量、镉富集量、土壤酶及土壤镉形态进行相关分析。利用Excel 2016和Origin 2021b软件进行作图。图表中数据为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 假单胞菌TCd-1对不同镉耐性水稻品种镉富集能力的影响

多因素方差分析表明(表1), 水稻各部位镉含量、镉富集量、镉富集系数(BCF)及转移系数(TF)在不同镉耐性水稻品种(V)、镉处理(Cd)及菌处理(B)间均存在显著差异(<0.05), 其中BCF与菌处理和水稻品种×菌处理间无显著相互作用, 籽粒镉富集量与水稻品种间无显著相互作用, 地上部和籽粒镉富集量与水稻品种×镉处理间无显著的相互作用, 其余各指标在水稻品种、镉处理及菌处理两两因素及三因素间存在显著的互作关系。

由表1可知, CK处理下, 接种菌株后水稻品种‘特优671’各部位的镉含量、镉富集量和富集系数(BCF)、转移系数(TF)均未发生显著性变化; 水稻品种‘百香139’除根部镉含量显著提高207.27%(<0.05)外其余部位镉含量均无显著变化, 而根部、地上部及全株镉富集量依次显著提高320.05%、22.81%和36.15% (<0.05), TF显著下降68.73% (<0.05), BCF提高6.72%。10 mg∙kg镉处理下, 接种菌株后水稻‘特优671’根部、地上部、籽粒及全株镉含量依次显著下降30.49%、40.35%、28.57%、34.53%(<0.05), 镉富集量依次下降33.72%、43.13%、29.61%、37.52% (<0.05), BCF下降35.14% (<0.05), 但对TF无显著影响; 水稻‘百香139’根部、地上部、籽粒及全株镉含量依次显著下降52.20%、46.64%、39.10%、47.74% (<0.05), 镉富集量依次下降29.80%、18.46%、0.09%、20.55% (<0.05), BCF显著下降47.19% (<0.05), 对TF亦无显著影响。结果表明镉污染条件下接种菌株能显著降低不同镉耐性水稻品种各部位的镉含量及镉富集量。

表1 菌和Cd互作处理对不同镉耐性水稻各部位镉含量、富集系数(BCF)、转移系数(TF)及镉富集量的影响Table1 Effects of Pseudomonas TCd-1, Cd and their interaction on Cd contents, bioconcentration factor (BCF), translocation factor(TF) and Cd accumulation of different Cd-tolerant varieties of rice

2.2 假单胞菌TCd-1对水稻根际土壤酶活性的影响

多因素方差分析表明(表2), 水稻根际土壤ACP、URE、CUE、CAT活性在水稻品种、镉处理及菌处理间均存在显著差异(<0.05或<0.01), 且水稻品种与镉处理、水稻品种与菌处理间均存在显著的相互作用; 镉处理及菌处理互作对URE和CUE活性有极显著影响(<0.01); SUC活性在水稻品种间差异显著, 水稻品种及镉处理间对PPO活性存在显著互作效应(<0.05), 水稻品种、水稻品种×镉处理和水稻品种×菌处理以及水稻品种×镉处理×菌处理对SUC活性有极显著影响(<0.01), 水稻品种×镉处理、镉处理×菌处理间对PPO活性存在显著的相互作用(<0.05)。可见不同镉耐性水稻品种的根际土壤酶活性存在显著差异, 菌和镉处理均显著影响两个水稻品种的根际土壤酶活性。

由表2可知, CK处理下, 接种菌株后‘特优671’根际土壤中ACP和CUE活性分别比CK提高13.21%和8.22% (<0.05), 其余酶活性无显著差异; ‘百香139’根际土壤中URE活性降低38.43% (<0.05), CAT和PPO活性分别提高8.33%和9.73% (<0.05), 其余酶活性无显著差异。

表2 菌和Cd互作处理对不同镉耐性水稻品种根际土壤酶活性的影响Table2 Effect of Pseudomonas TCd-1, Cd and their interaction on enzymes activities in rhizosphere soil of different Cd-tolerant varieties of rice

10 mg·kg镉处理下, ‘特优671’根际土壤中的ACP、URE和CUE活性比CK处理分别显著提高31.13%、23.13%和10.91% (<0.05), CAT活性降低15.22%; 与Cd处理相比, 接种菌株后ACP、URE、SUC、CUE和PPO活性分别降低7.19%、9.39%、25.53%、16.20%和11.44% (<0.05), CAT活性提高5.13% (<0.05)。Cd处理下, ‘百香139’根际土壤CAT和PPO活性比CK处理 分别显著提高8.33%和12.20% (<0.05), ACP、URE、SUC和CUE活性分别显著降低12.24%、19.44%、17.24%和13.29%(<0.05); 接种菌株后除PPO活性降低12.40%外(<0.05), ACP、URE、SUC、CUE和CAT活性分别提高26.74%、12.07%、62.50%、81.17%和5.13%(<0.05)。结果表明，镉处理下6种土壤酶对两种水稻根际土壤的响应存在相反的差异表现，且添加假单胞菌TCd-1均能显著恢复由镉对土壤酶活性带来的影响。

2.3 假单胞菌TCd-1对水稻根际土壤镉形态的影响

多因素方差分析表明(表3), 水稻根际土壤中FeMnO-Cd含量在水稻品种、镉处理及菌处理间均存在显著的相互作用(<0.05或<0.01), EXC-Cd、Crab-Cd、FeMnO-Cd和RES-Cd含量在水稻品种间差异显著, 镉处理及菌处理互作对EXC-Cd、FeMnO-Cd和OM-Cd含量有显著影响, 且镉处理对5种形态的镉都有极显著的影响(<0.01), 水稻品种×镉处理和水稻品种×菌处理以及水稻品种×镉处理×菌处理对Crab-Cd含量有显著影响(<0.05)。

由表3可知, CK处理下, 不同镉耐性水稻根际土壤各种镉形态含量及占比具有显著差异, ‘特优671’根际土壤EXC-Cd含量占比最大, 达47.06%; ‘百香139’根际土壤中的RES-Cd含量占比最大, 达43.75%; 接种菌株后两种水稻根际土壤中的 5种镉形态含量均未发生显著性变化。在10 mg·kg镉处理下, 接种菌株后‘特优671’根际土壤中EXC-Cd和Crab-Cd含量分别降低15.89% (<0.05)和11.71%, 而FeMnO-Cd、OM-Cd和RES-Cd含量分别升高39.58% (<0.05)、36.11% (<0.05)和18.64%。与Cd处理相比, CdB处理下‘百香139’根际土壤中EXCCd含量降低23.81% (<0.05), 而Crab-Cd、FeMnO-Cd、OM-Cd和RES-Cd含量依次升高33.09% (<0.05)、28.81%、25.00% (<0.05)和3.30%。

表3 菌和镉互作处理对不同镉耐性水稻根际土壤中不同形态镉含量的影响Table3 Effect of Pseudomonas TCd-1, Cd and their interaction on different forms of cadmium in rhizosphere soil of different Cdtolerant varieties of rice mg·kg−1

2.4 稻米镉含量与土壤镉形态及土壤酶活性的相关性

如图1A所示, 在未接种菌株处理下, ‘特优671’植株根部、地上部及籽粒的镉含量及镉富集量与根际土壤中EXC-Cd、Crab-Cd、FeMnO-Cd、OM-Cd、RES-Cd等5种形态镉含量以及URE、ACP、CUE活性均呈显著正相关(0.05), 与CAT活性呈显著负相关(<0.05); ‘百香139’各部位的镉含量及镉富集量与根际土壤中5种形态镉含量和PPO、CAT等酶活性均呈显著正相关(0.05), 而与URE、ACP、SUC、CUE活性显著负相关(0.05)。

由图1B可知, 接种菌株后, ‘特优671’植株根部、地上部及籽粒不同部位镉含量和镉富集量与5种土壤镉形态、URE和ACP活性呈显著正相关(0.05), 与根际土壤PPO、CAT、SUC、CUE活性呈显著负相关(0.05); ‘百香139’各部位镉含量及镉富集量与根际土壤中URE、SUC、CUE活性及5种土壤镉形态均呈显著正相关(0.05), 而与PPO呈显著负相关(0.05)。

图1 高镉耐性(上三角矩阵)和低镉耐性(下三角矩阵)水稻接种假单胞菌TCd-1前(A)后(B)的镉含量、镉富集量、土壤酶活性及镉形态的相关性Fig.1 Correlation among Cd content, Cd accumulation, soil enzyme activity and soil Cd forms contents for high Cd-tolerant rice variety ‘Teyou 671’ (upper triangular matrix) and low Cd-tolerant rice variety ‘Baixiang 139’(lower triangular matrix) before (A) and after (B) Pseudomonas TCd-1 inoculation

3 结论与讨论

3.1 假单胞菌TCd-1通过降低不同镉耐性水稻品种的镉富集能力减轻了镉污染

植物对镉吸收能力主要取决于其物种特性, 同时受多种因子调控。根系是植物从土壤中吸收镉的重要器官, 也是植物积累镉的主要部位。研究表明, 在土壤背景条件下, 低耐性水稻品种根部和地上部的镉含量显著高于高耐性水稻品种, 其BCF、TF亦显著高于高耐性水稻品种, 表现出更强的镉吸收与转运能力(表1); 接种假单胞菌TCd-1能够进一步促进低耐性水稻品种根部的镉吸收, 并降低TF, 但对高镉耐性水稻品种根部的镉吸收及TF无显著影响(表1)。在添加镉的处理中, 低耐性水稻品种的BCF、TF亦均显著高于高耐性水稻品种, 地上部镉含量显著高于高耐性水稻品种, 表现出更强的镉吸收与转运能力, 但高耐性水稻品种吸收的镉主要积累在根部(表1); 接种菌株显著降低了不同耐性水稻品种各部位的镉含量, 其主要作用机制是降低了镉污染水稻的BCF, 降低了水稻根系的镉吸收, 但对其TF无显著影响。可见, 低镉耐性水稻品种具有更高的TF, 吸收的镉更易转移并积累至地上部, 而高镉耐性水稻品种吸收的镉主要积累在根部, 两者在应答镉污染上表现出不同的适应对策。低镉耐性水稻品种根部吸收的镉转移至地上部, 将直接降低水稻的光合作用与生长, 这是导致其镉耐性降低的主要原因。前人研究表明, 土壤微生物能够通过生物吸附、生物积累、沉淀、络合和转化等方式来缓解土壤重金属对植物的胁迫。一些菌株可通过固定土壤中的镉, 促进土壤钙、镁等元素的淋溶, 改变土壤酶活性和镉的生物有效性, 从而降低水稻籽粒中镉的积累。本研究发现, 接种假单胞菌TCd-1显著降低了镉污染下水稻各部位的镉含量, 主要表现为降低了水稻根系对镉的吸收, 从而抑制了水稻的镉富集作用。表明假单胞菌TCd-1参与了水稻的镉富集过程, 这可能与假单胞菌TCd-1既是植物根际促生菌, 兼具镉耐性与富集能力, 能够螯合、固定或转化土壤的镉, 减轻镉毒害有关。但菌株对不同镉耐性水稻品种根际过程的影响有待进一步的深入研究加以阐明。

3.2 假单胞菌TCd-1通过降低土壤镉的生物有效性抑制水稻的镉吸收

重金属的生物有效性是指重金属能被生物吸收或对生物产生毒性的有效性状。重金属在土壤中经过络合、吸附、凝聚、溶解、沉淀等各种化学反应可形成各种具有不同生物有效性的赋存形态。镉极易被植物吸收利用, 其在土壤中的赋存形态直接影响镉的生物有效性, 其中可交换态(EXC-Cd)与碳酸盐结合态(Crab-Cd)易直接被植物吸收利用, 铁锰氧化物结合态(FeMnO-Cd)和有机物结合态(OMCd)镉可因环境转变为其他形态, 较难被植物利用, 残渣态镉(RES-Cd)几乎不能被植物利用。本研究发现, 在自然背景条件下, 水稻根际土壤中各种形态的镉含量均较低, 接种菌株对不同镉耐性水稻品种根际土壤镉形态均无显著影响(表3)。镉处理下, 低镉耐性水稻品种根际的EXC-Cd含量远低于高镉耐性水稻品种, 但RES-Cd含量显著高于高镉耐性水稻品种, 这可能与低镉耐性水稻品种对镉的吸收及转移能力较强, 为适应镉污染环境, 通过根系分泌、螯合、沉淀等过程钝化并抑制镉吸收有关。接种菌株后, 高镉耐性水稻品种根际土壤中EXC-Cd含量降低, FeMnO-Cd和OM-Cd含量提高, Crab-Cd和RES-Cd含量无显著变化; 类似地, 低镉耐性水稻品种根际土壤的EXC-Cd含量降低, Crab-Cd和OM-Cd含量提高, FeMnO-Cd和RES-Cd含量无显著变化。表明假单胞菌TCd-1可显著降低水稻根际土壤EXCCd含量, 从而有效抑制水稻的镉吸收。菌株亦可提高低镉耐性水稻品种根际土壤Crab-Cd、OM-Cd含量及高镉耐性水稻品种FeMnO-Cd、OM-Cd含量, 促进易被植物利用的有效态向无效态转化, 减少水稻对有效态镉的吸收与富集, 从而降低镉对植物的毒害。这可能与假单胞菌TCd-1的添加能提高水稻根际土壤pH, 进而影响土壤镉形态变化有关, 也可能与植物不仅可通过分泌外源调节物质影响土壤重金属的赋存形态, 还可利用根际微生物的氧化、还原等生物化学作用降低重金属生物有效性, 减轻重金属对植物和微生物自身的毒害有关。

3.3 假单胞菌TCd-1通过恢复根际土壤酶活性增强了水稻的耐镉能力

土壤酶由土壤动物、土壤微生物和植物根系共同作用产生, 是土壤生化反应的催化剂, 能够直接或间接参与重金属的生物地球化学循环过程, 其活性受环境因子等多种因素影响。土壤URE、ACP、SUC和CUE是维持生态系统碳和养分循环过程的重要水解酶, CAT和PPO则参与了土壤氧化还原反应, 与土壤有机质的转化、腐殖质的形成密切相关。一些研究表明, 土壤酶活性可敏感地反映土壤理化性质及重金属污染程度。本研究表明, 不同镉耐性水稻品种根际土壤酶活性对镉污染表现出不同的应答模式, 其中高镉耐性水稻品种根际土壤中的ACP、URE、CUE活性在镉胁迫下显著升高, 而CAT活性显著降低, SUC、PPO活性无显著变化, 接种菌株后ACP、URE、SUC、CUE和PPO活性显著下降, 而CAT活性显著升高(表2); 低镉耐性水稻品种根际土壤的ACP、URE、SUC和CUE活性均显著下降, CAT和PPO活性显著上升, 接种菌株后, ACP、URE、SUC、CUE和CAT活性显著上升, 而PPO活性下降(表2)。由此可见, 镉污染能够导致水稻根际土壤酶活性发生明显的变化, 这与重金属能占据部分酶的活性位点进而抑制酶活有关, 也可能促进酶活性位点与底物的配合而提升酶活。接种假单胞菌TCd-1则能够明显地修复因镉污染导致的土壤酶活的改变, 有利于土壤物质循环功能的恢复。土壤微生物是土壤酶的主要来源, 土壤镉污染会通过抑制土壤微生物的生长, 从而影响酶的分泌与活性。外源添加有益微生物不仅可以影响土壤酶活性, 还能改变重金属有效性及水稻的生理活性, 改善植株根际微生态环境而有利于水稻生长。假单胞菌TCd-1分离自水稻根际土壤, 属于植物根际促生菌, Qian等利用高通量16S rRNA基因测序技术, 发现假单胞菌TCd-1显著改变了不同镉浓度下水稻根际细菌群落的α多样性、群落组成和物种间的相互作用。细菌群落的变化可能有助于创造有利的根际微生物环境, 恢复镉污染下对水稻根际微生物菌群结构平衡, 促进根际土壤生化过程, 进而促进水稻生长, 减少水稻根系对镉的吸收。考察水稻镉含量与土壤酶活及土壤镉形态之间相关性可知(图1), 接种假单胞菌TCd-1前后, 除CAT活性之外, 其余土壤酶活性与水稻各部位的镉含量和土壤镉形态之间的相关性变化显著, 假单胞菌TCd-1降低水稻镉吸收与改变其根际土壤酶活性密切相关。

4 结论

接种假单胞菌TCd-1可以显著降低10 mg∙kg镉污染水稻根部、地上部、籽粒等部位的镉含量, 且显著影响了不同镉耐性水稻品种的镉吸收富集特性, 低镉耐性水稻品种的Cd富集系数和转移系数变化较高镉耐性水稻品种更显著。接种假单胞菌TCd-1降低镉的生物有效性, 并恢复镉污染土壤中的土壤酶活性, 进而有效缓解土壤中镉的毒害作用, 降低水稻各部位对镉的吸收和积累, 最终降低水稻的镉含量。