高效液相色谱串联质谱法测定大米中维生素B1含量※

●董 欣 赵佳宁 王 博 毕 玉 袁海涛 郭丹丹

（兴安盟疾病预防控制中心 内蒙古 乌兰浩特 137400）

维生素B1（Vitamin B1，VB1）又称硫胺素，具有维持人体正常糖代谢、参与神经传导的作 用[1-2]。稻谷中含有丰富的B族维生素，VB3和VB1最为丰富[3]。目前，谷物中VB1的测定方法主要为高效液相色谱紫外检测法和光检测法[4-5]， 其样品前处理复杂，检测时间长，而近些年关于大米中VB1测定的研究多集中在高效液相法[6]， 对于液质法测定多集中在婴幼儿食品、功能性饮料等或饲料领域中[7-9]，但缺乏液质法测定大米中VB1的相关报道。本研究建立了高效液相色谱串联质谱仪测定大米中VB1的方法，在快速检测、提升效率、降低成本等方面具有重要 意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 大米样品001号：泰勒银珠大米；002号：绿色草原长粒香大米；003号：蒙佳有机大米；004号：蒙佳稻花香；005：蒙望农业私人订制；006号：魏佳兴安盟大米；007号：魏佳留胚米；008号：绰尔蒙珠哈斯香米；009号：草原三合大米。

1.1.2 试剂VB1标准品：坛墨质检科技股份有限公司，纯度≥99.0%；乙酸铵：优级纯，西亚试剂有限公司；甲醇：色谱纯，飞世尔试剂；甲酸：优级纯，国药集团化学试剂有限 公司。

1.2 仪器设备

XPE105十万分之一电子天平：梅特勒-托利多公司；H-CLASS+TQD高效液相色谱串联质谱仪：Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理准确称取40目筛下大米粉末0.5～2 g（精确至0.01 g），置于250 mL锥形瓶中，加入60 mL 0.02 moL/L乙酸铵溶液，超声提取 20 min，冷却至室温，溶液及残渣定容至100 mL容量瓶中，离心，上清液过0.22 μm滤膜。

1.3.2 标准曲线的配制VB1标准储备液 （500 μg/mL）：准确称取干燥后的维生素B1标准品56.1 mg（精确至0.1 mg），相当于50 mg硫胺素，用0.01 moL/L盐酸溶解并定容至100 mL，摇匀。VB1标准中间液（10 μg/mL）：准确移取标准储备液2 mL，用水定容至100 mL容量瓶中，摇匀。VB1标准工作液：吸取一定量VB1标准中间液，配成浓度为0，2.0，5.0，10，20，50，100 ng/mL 的标准系列。

1.3.3 色谱条件色谱柱：HSS T3色谱柱（粒 径1.8 μm，100 mm×2.1 mm）；流 动 相： 0.02 mol/L乙酸铵溶液-0.1%甲酸甲醇；流速： 0.3 mL/min；进样量：2 μL；柱温：40℃。洗脱梯度，见表1。

表1 液相洗脱条件

1.3.4 质谱条件离子化模式：ESI+，多选择反应监测（MRM），毛细管电压：1500 V，离子源温度：150℃，脱溶剂温度：350℃，锥孔气流量：50L/Hr，脱溶剂气流量：650 L/Hr。MRM条件，见表2。

表2 MRM多选择监测模式下维生素B1的仪器优化条件

2 结果与分析

2.1 样品提取溶剂的选择

分别用水、0.02 moL/L乙酸铵、20%甲醇提取大米样品中VB1，按本文“1.3.1”样品处理方法提取。结果表明：用水和20%甲醇提取同一样品中的VB1时的峰面积比用0.02 moL/L乙酸铵提取VB1时小，0.02 moL/L乙酸铵可以充分提取大米中的VB1，故选用0.02 moL/L乙酸铵作为样品提取溶液（图1）。

图1 提取溶剂单因素试验

2.2 样品提取溶剂体积及时间的选择

称取1 g样品5份，分别做提取体积（20，40，60，80，100 mL）和提取时间（5，10，15，25，30 min）的单因素试验，结果表明：提取体积在60 mL、提取时间为20 min时响应值最高，样品提取率最优（图2和图3）。

图2 提取时间单因素试验

图3 提取体积单因素试验

2.3 色谱柱的选择

试验对比了Waters ACOUTUTY UPLC HSS T3 （2.1×100 mm，1.8 μm） 和Waters BEH C18 （2.1×100 mm，1.7 μm）2种色谱柱，在相同条件下T3色谱柱峰型尖锐、对称，C18色谱柱峰型较 宽、存在拖尾、分叉现象（图4和图5）。

图4 Waters ACOUTUTY UPLC HSS T3色谱柱VB1离子流图

图5 Waters BEH C18 色谱柱VB1离子流图

2.4 流动相及比例的选择

对比0.02 mol/L乙酸铵溶液-0.1%甲酸甲醇与0.02 mol/L乙酸铵溶液-甲醇2种流动相发现，添加0.1%甲酸的流动相分离效果较好，峰型对称尖锐（图6和图7）。

图6 未加甲酸时的离子流图

图7 加入甲酸时的离子流图

在添加0.1%甲酸作为流动相的条件下，等度（99+1）洗脱时峰型拖尾，而采用表1中的梯度洗脱，VB1的峰形尖锐且对称，故选择梯度洗脱（图8和图9）。

图8 梯度洗脱离子流图

图9 等度洗脱离子流图

2.5 质谱条件的优化

在正离子检测模式下，进行手动调谐，以5μL/min流量注入离子源进行母离子质谱扫描，确定母离子响应较高、稳定且丰度大时的毛细管电压、锥孔电压，再将母离子打碎进行子离子扫描，调节碰撞能，确定两对子离子响应较大时的碰撞能。

2.6 线性范围和检出限

按照本试验研究方法，对VB1标准系列进行测定，3倍信噪比（S/N）作为检出限，10倍信噪比（S/N）作定量下限，结果见表3。

表3 线性回归方程、相关系数、检出限及定量下限

2.7 回收率和精密度

按照试验方法对兴安盟地区9种大米样品做加标回收试验，6次平行试验，计算其加标回收率和相对标准偏差，结果表明：本试验方法加标回收率在90%～97%，相对标准偏差（RSD）在0.87%～1.37%。

表4 加标回收率和精密度试验结果（n=6）

2.8 实际样品的测定

应用上述方法及国标方法[10]对兴安盟地区9种品牌大米进行VB1检测，结果见表5。

从表5可以看出，本方法与国标检测方法结果相差不大，但国标方法样品预处理操作复杂，耗时较长，而本方法检测结果与国标方法一致，而样品提取步骤简单，减少了损耗，缩短了检测时间，检验结果准确。

表5 兴安盟地区9种大米VB1测定结果 单位：mg/kg

3 结论

建立高效液相色谱串联质谱仪测定大米中维生素B1含量的方法，分析速度快、操作方法简单、出峰时间稳定、精密度和准确度均可满足分析要求，适宜在大米及谷物类食品中应用。