毛细管多重电泳技术鉴定水稻种子纯度研究

范家萌，王至严，林慧慧，周桂林，王浩波

(合肥丰乐种业股份有限公司，农作物种子新技术与新品种创制安徽省重点实验室，安徽合肥 230088)

品种纯度是衡量种子质量的重要指标，品种纯度鉴定包括田间鉴定和室内鉴定2种方法。田间鉴定是在作物生育期间，结合检查病虫杂草以及田间生育状况和倒伏情况对田间进行品种纯度检验，耗时费力。室内纯度鉴定目前主要是SSR分子标记鉴定。SSR分子标记技术是一种基于扩增PCR和微卫星定位的DNA特性的标记技术，微卫星DNA的长度呈现高度变异，但是其两侧的碱基序列高度保守，因此可以根据保守序列，设计引物对DNA进行PCR扩增，通过扩增产物的长度多态性，揭示不同的个体或品种间的遗传差异。该技术一直以高效、准确可靠、不受环境影响等优势而得到广泛应用。

分子标记鉴定的效率和成本主要取决于PCR产物电泳所用仪器及电泳方法。目前分子标记鉴定技术中电泳分析环节包括3种途径：①聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)；②ZAG单色毛细管电泳仪电泳；③DNA分析仪的荧光电泳。其中PAGE操作复杂、分辨率不高、效率低；在试验操作过程中会有试剂污染，对实验员及实验室安全卫生都有不同程度的影响。DNA分析仪的荧光电泳由于仪器和试剂价格昂贵，运行成本高，在商业化应用中受到极大限制。ZAG单色毛细管电泳仪以进样量少、分析速度快、分离效率高、有机溶剂少、自动化程度高等特点被广泛应用于分子生物学、医药学、高分子等领域，但由于是单色荧光显色，试剂耗材依靠厂家提供，造成单重电泳的使用成本偏高。笔者拟采用混合不同片段大小的PCR产物进行多重电泳，以提高试剂耗材的利用率，进一步提升ZAG单色毛细管电泳仪的使用效能。

1 材料与方法

试验品种。随机选用合肥丰乐种业股份有限公司2021年生产的杂交水稻品种丰两优3305与常规稻品种润稻118。

试剂来源。PCR反应所用Buffer、DNTP等试剂购于上海生工生物工程有限公司，引物合成于安徽通用生物科技有限公司，酶购于艾科瑞生物科技有限公司，试验耗材购于合肥舜田实验部。

主要仪器设备。T100型梯度PCR仪，美国伯乐(Bio-Rad Laboratories，Inc.)公司；Nanodrop 2000C 型核酸蛋白分析仪，美国热电公司；ZAG-Z7576毛细管电泳仪，Agilent公司生产。

DNA快速提取及质量检测。每个品种随机取96株幼苗，每株幼苗取0.8 cm×0.8 cm大小的样品，放入PCR板中，加入0.25 mol/L NaOH溶液20 μL，放进水浴锅中99 ℃煮2 min，然后加入0.25 mol/L Tris-HCl溶液30 μL后冷却。用核酸蛋白分析仪检测DNA的浓度和质量，DNA浓度在15～50 ng/μL，DNA质量在1.8～2.0。

PCR反应体系及扩增程序。PCR反应体系(10 μL)：DNA模板2.0 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，ddHO 4.5 μL，PCR Master Mix 2.5 μL。PCR扩增反应程序：94 ℃预变性4 min；然后每个循环变性：94 ℃15 s，退火55 ℃30 s，延伸72 ℃ 30 s。循环次数32次，72 ℃保温10 min。

SSR分子标记引物选择。根据GB/T 39917—2021《主要农作物真实性和纯度SSR分子标记检测 稻》中推荐的8对候选引物，参照丰两优3305的指纹图谱，找到丰两优3305双亲带型有差异的引物，分别是RM336、RM208、RM224、RM8277、RM19，在RM19标记位点上的指纹是245/251，父母本差异偏小，排除该标记位点，用RM224、RM8277、RM336、RM208进行纯度鉴定并组合双重电泳。根据润稻118品种的SSR分子标记上的带型，选择多态性较好且产物片段大小差异较大的3个引物RM224、RM8277、RM19进行SSR分子标记纯度鉴定(表1)。

毛细管电泳。

普通单重毛细管电泳。将96孔PCR产物加buffer定容至25 μL，打开ZAG软件后，选择样品托盘Sample tray→ 添加托盘Add tray to queue → 选择跑胶模式(1板费胶模式+8板省胶模式)→ 点击Edit更改电泳参数，一般设置电压4～5 kV，室温高于25 ℃时，每板电泳时间在50 min左右，温度越低，电泳时间越长。更改参数后之后点击OK，在待电泳界面点击绿色运行标识即可进行电泳。

多重毛细管电泳。扩增产物采用单色ZAG-Z7576毛细管电泳仪。将2～3个不同引物的PCR扩增产物混合，每个扩增产物取5 μL至新的96孔PCR扩增板，然后加双蒸水定容至25 μL。软件及仪器操作步骤与单重毛细管电泳一致。

表1 水稻纯度鉴定SSR分子标记

纯度统计。

样品纯度=(供检株数-杂株数)/供检株数×100%

2 结果与分析

丰两优3305在RM224标记位点上的纯度检测结果见图1，1 bp和500 bp处是试剂盒Marker的范围，即PCR产物片段在1～500 bp。丰两优3305在RM224标记位点的片段是159(母本带)/185(父本带)(表1)。H2孔没有扩增产物，记为空，供检株数94株，A8孔的带型是母本带159和非父本带196；H6孔是仅一条母本带159，H12孔是标尺(图1)。

图1 丰两优3305在RM224 标记位点的带型Fig.1 The band pattern of Fengliangyou 3305 at the RM224 marker

丰两优3305在RM8277标记位点上的纯度检测结果见图2，Marker与图1一致。该产物片段是220(父本带)/234(母本带)(表1)。A8和H2孔没有产物，记为空，H12孔是标尺。供检株数93株，所有单株的PCR产物带型一致，没有杂带(图2)。

丰两优3305在RM336标记位点上的纯度检测结果见图3，产物片段是133(父本带)/159(母本带)(表1)。其中，A2、G1、G2、H4、H5共5个孔没有扩增产物，记为空，供检株数91株，A4和H1孔都是1条母本带159，其他孔带型一致。

丰两优3305在RM208标记位点上的纯度检测结果见图4，产物片段是143(父本带)/164(母本带)(表1)。供检株数96株，H7是一条母本带164，其他孔带型一致。

该试验对丰两优3305在RM224、RM8277、RM336、RM208标记位点进行纯度鉴定，鉴定结果汇总见表2。GB 4404.1—2008《粮食作物种子》标准中规定，水稻杂交种的大田用种纯度不低于96.0%。由表2可知，4个标记位点的纯度结果均高于标准值。

将丰两优3305的RM224和RM8277的PCR产物混匀到同一96孔板，加水至25 μL，双重电泳结果见图5。条带159/185是RM224标记的产物片段，条带220/234是RM8277标记的产物片段。和单重电泳结果比较，结果一致，且2个标记的产物之间没有影响。

图2 丰两优3305在RM8277标记位点的带型Fig.2 The band pattern of Fengliangyou 3305 at the RM8277 marker

图3 丰两优3305在RM336标记位点的带型Fig.3 The band pattern of Fengliangyou 3305 at the RM336 marker

图4 丰两优3305在RM208标记位点的带型Fig.4 The band pattern of Fengliangyou 3305 at the RM208 marker

表2 丰两优3305的SSR分子标记纯度鉴定结果

将丰两优3305的RM336、RM208的产物PCR产物混匀到同一96孔板，加水至25 μL后混合进行双重电泳。条带133/159是RM336标记的产物片段，条带143/164是RM208标记的产物片段。如图6所示，133和143两个片段可以区分，而159和164两个片段相差5 bp，带型有重合，无法判读结果。

图5 丰两优3305在RM224、RM8277标记位点的双重电泳Fig.5 Double electrophoresis of Fengliangyou 3305 at the marked sites of RM224 and RM8277

图6 丰两优3305在RM336、RM208标记位点的双重电泳Fig.6 Double electrophoresis of Fengliangyou 3305 at the marked sites of RM336 and RM208

根据丰两优3305双重电泳结果可知，不同引物的产物片段差异超过10 bp可以进行混合电泳，产物之间没有影响，与单重电泳结果一致。润稻118纯度检测RM224、RM8277、RM19的片段大小分别是132/132、147/147、201/201，之间相差均在10 bp以上，产物可以混合电泳。3个标记产物多重电泳结果见图7。在RM224标记位点上，F8没有扩增产物，记为空，供检株数94株，其他带型一致没有杂带；在RM8277标记位点上没有杂带和空孔；在RM19标记位点上，H11孔显示是杂带，其他带型一致。由表3可知，在RM224、RM8277、RM19标记位点上，润稻118的纯度分别为100%、100%、98.9%。

图7 润稻118在RM224、RM8277、RM19标记位点的三重电泳Fig.7 Triple electrophoresis of Rundao 118 at marker sites of RM224，RM8277 and RM19

3 结论与讨论

该试验选用丰乐水稻杂交品种丰两优3305和常规稻品种润稻118的不同引物进行单重和多重电泳比对。结果表明，相差10 bp以上的PCR产物混合两重和三重电泳，对检测结果没有影响。该试验在鉴定水稻杂交品种纯度时，结合实际选用2个分子标记进行试验。今后在分子标记纯度鉴定中可以根据需要混合更多引物，验证杂交种更多重的毛细管电泳效果。

根据SSR分子标记纯度鉴定结果可以看出，同一品种在不同标记位点上的纯度结果不同，如丰两优3305品种在RM224标记位点上纯度结果是97.9%，在RM8277标记位点上是100%。可能是该品种的父母本在RM224标记位点上轻微分离造成的。通过分子标记和田间纯度鉴定结果比较分析，父母本在某个位点轻微分离，但不会造成品种表现型的变化，分子标记纯度鉴定时应排除该标记位点。

表3 润稻118的纯度鉴定结果

该试验研究的多重毛细管电泳检测技术，通过不同标记的产物进行混合多重电泳，即混合不同大小的DNA片段在一个毛细管上进行电泳，混合3个PCR产物成本可以从2～3元降低到0.7～1.0元，相应的电泳时间也缩短了2倍，多重毛细管电泳既降低检测成本又提高试验效率，进一步提升了毛细管电泳使用效能，为分子标记鉴定技术更广泛的应用提供技术支撑。

安徽省地方标准DB 34/T 3308—2018《两系杂交水稻种子纯度检测 分子标记法》规范了两系水稻分子纯度检测的流程，针对的是PAGE电泳方法。国家标准GB/T 39917—2021《主要农作物真实性和纯度SSR分子标记检测 稻》，该标准的纯度检测毛细管电泳部分主要是针对DNA分析仪的多色荧光毛细管电泳技术。该试验研究一种混合单色多重PCR产物的电泳技术，综合了PAGE电泳与DNA分析仪的优点，既可以克服单重电泳成本高的问题，又进一步规范毛细管电泳的技术流程和操作细节，保证试验结果的稳定性。