一株稻田固氮蓝藻的分离鉴定及其镉耐受和去除能力评估

张定煌，朱 嫡，李拥军，苏增强，李 杰，贺鸿志*

(1.中山市农产品质量安全检验所，广东中山 528400；2.华南农业大学资源环境学院，广东广州 510000；3.清远职业技术学院，广东清远 511500)

镉(Cd)污染治理是当前国家的重大需求，国内外研究表明微藻可能在Cd污染水体处理方面具有很大潜力。固氮蓝藻是热带亚热带地区重要的微生物资源，自从1889年Franck发现了固氮蓝藻，到20世纪末期已得出20多个属的150多种蓝藻具有固氮能力。我国记载了800多种蓝藻，其中有固氮能力的就有70多种。且我国很早就有将固氮藻类中的葛仙米和发菜等作为食品和药物使用的记载，已经成了价格高昂的保健食品。研究表明稻田中接种固氮蓝藻可显著增产，如在湖北晚稻田中测得其固氮量为22.5～37.5 kg/hm。随全球变暖和水体富营养化日益严重，固氮蓝藻的农业应用和生态价值将日益凸显。同时，研究表明固氮蓝藻在生物活性物质发掘、新能源开发、功能食品研制和环境保护等方面均具有重要的应用前景。固氮蓝藻蛋白质含量高，氨基酸组成完全，含有丰富的维生素和微量元素，在生长繁殖过程中还可分泌出少量的氨基酸、激素等活性物质促进作物生长。固氮蓝藻还可以用于环境污染修复，并已有利用藻菌结合体清除石油污染的报道。一些固氮蓝藻可以用于水体营养物质和重金属的去除。同时，固氮蓝藻还具有修复水体农药和染料等污染的潜力。已有很多利用筛选到的固氮蓝藻结合固定化技术进行了应用技术方面的探索。另外，在我国西北地区丝状固氮蓝藻已被用于荒漠和盐碱化土壤治理中，并获得了不错的效果。

国内已有对湖北、湖南、江西、北京、延边、西北荒漠区等地的固氮蓝藻资源的调查研究，并分离纯化了不少固氮藻株，但关于广东、广西、海南等省份固氮蓝藻的研究非常少。现在中国科学院武汉水生生物研究所藻种库保存的藻种主要来自湖北、湖南和江西等亚热带地区，可以预见属热带、亚热带的海南、广东、广西部分地区必定有不少的固氮蓝藻种质资源待发掘，甚至可能会有某些特殊功能的种类存在。笔者从中山实验田采集土样、水样，然后经过紫外线法、抗生素法将其纯化为单一藻株，鉴定出藻种为念珠藻，通过重金属Cd对念珠藻的急性试验，评估Cd对念珠藻的生态毒理效应，研究其对镉的耐受能力和去除能力。

1 材料与方法

试验所用固氮蓝藻培养基为无氮BG11(BG11)。除培养基以外，所用的药品还包括乙醇、(1+1)盐酸溶液、邻苯二甲酸氢钾、磷酸氢二钠、硼砂、氯化钾、pH=4.01 标准缓冲溶液、pH=6.87 标准缓冲溶液、pH=9.18标准缓冲溶液、20 mg/L的镉溶液。

100 mL锥形瓶、50 mL锥形瓶、分光光度计、TOC 分析仪、往复式振荡器、磁力搅拌仪、光照培养箱、微孔滤膜、离心管、试管、烧杯、滴管、移液枪(20 μL、200 μL、1 000 μL、5 mL)、电子天平、4 ℃冰箱、-40 ℃冰箱、比色皿、各种规格培养皿、酒精灯、接种环、高压灭菌锅、带相机和视频摄像头的Olympus倒置显微镜、低温高速离心机、冻干机、超净工作台、抽滤装置、纯水机、酸度计。

藻的富集培养。将从中山实验田采集回来的土样、水样取少量放入100 mL锥形瓶中，分别加入40 mL无氮BG11培养基放在恒温培养箱中进行富集培养，培养条件为温度(27±1)℃、光照(2 700±50)lx、光暗比16 h∶8 h。

藻株分离。培养20 d后，将富集培养的藻样用移液器移取20～50 μL涂布于含BG11的琼脂固体平板上。等长出肉眼可见的藻后，用接种环小心挑取，在新的固体培养基上Z字形划线转接，重复此操作直到纯化出单一藻种为止。分离方法：在超净工作台内，将接种环在酒精灯上灼烧，接种环除菌后蘸取少许待纯化藻类，在无菌BG11固体培养基表面进行平行划线、扇形划线或Z字划线的连续划线，用无菌的Parafilm对培养皿进行封口，放在培养箱中倒置培养，用以分离出单个菌落。待长出单个菌落后，在显微镜下观察藻的形态、细胞结构，看是否为单一藻株，若不是单一藻株，再采用相同的方法或者毛细管分离法、梯度稀释法进行分离，直至找到单一藻株。

藻种纯化。用抗生素、抗菌酮等处理，除菌、纯化藻株，具体步骤为先分别在5个50 mL 锥形瓶中加入BG11培养液 20 mL，经过高压蒸汽灭菌后，冷却，在超净工作台接种2 mL藻株在50 mL锥形瓶中；同时配制氨苄青霉素、硫酸庆大霉素、卡那霉素、链霉素4 种抗生素的混合浓缩液共10 mL，浓度均为 2 g/L，在超净工作台中用无菌的一次性过滤头和针筒过滤混合液，装在预先灭菌的玻璃锥形瓶中；然后分别取2 g/L的混合抗生素母液10、8、6、4、2 μL加至上述含BG11培养液20 mL的5个50 mL锥形瓶中，处理 3 d。3 d后离心机15 ℃、7 000 r/min离心7 min，弃去上清液，随后沉淀用无菌水离心清洗3 次，划平板，用封口膜封口，放入培养箱中培养。重复上述操作直至通过显微镜观察不到明显的菌生长。藻株的保存采用固体培养基斜面或平板保种(常温或低温)和液体培养基保种相结合的方法。

藻株的扩大培养。在1个 50 mL锥形瓶中加入BG11培养液20 mL，经过高压蒸汽灭菌后，冷却，在超净工作台中用接种环从分离纯化后的固氮蓝藻培养皿中刮取少量藻株接种到上述锥形瓶中，确保要刮取到藻，然后放培养箱中培养，每天定时摇瓶4～6 次。

采用分子生物学方法对蓝藻进行鉴定，通过选择有代表性的基因序列片段作为分类标准来区分不同生物、同种生物种内株系之间的遗传差异，此方法操作容易、结果可靠。

将筛选出来的优良藻株用16S rDNA序列分析法进行鉴定，即用一对引物27F(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)和 1492R(TACGGYTACCTTGTTACGACTT)进行PCR扩增，通过测序确定16S rDNA序列，再通过 Genebank 进行 Blast 比较分析确定藻株所属的属。在此基础上，用两对引物CX(5′-GGCGCAGGTAAGAAAGGGTTTCGTA-3′)、CW(5′-CGTAGCTTCCGGTGGTATCCAC GT-3′)对固氮蓝藻基因进行扩增和测序。通过 Blast比较分析进行藻种鉴定。

取8个50 mL锥形瓶，每个瓶中装20 mL的BG11培养基。向锥形瓶中加入不同体积Cd母液(20 mg/L)，使瓶中Cd最终浓度分别为0、0.025、0.050、0.100、0.200、0.400、0.600和0.800 mg/L。每个瓶中再加入2 mL培养到对数生长期的藻种液。培养4 d后在超净工作台取3 mL均匀藻液测OD值，并观察藻细胞的变化。

取100 mL锥形瓶，每个瓶装40 mL的BG11培养基。向锥形瓶中加入不同体积Cd母液(20 mg/L)，使Cd最终浓度分别为0.1和0.2 mg/L。每个瓶中再加入2 mL培养到对数生长期的藻种液。放入培养箱中培养，分别在24和48 h后取样抽滤，然后用原子吸收法进行Cd浓度的测定。

取正常生长和0.2 mg/L Cd处理4 d后的藻液高速离心收集藻细胞，用冻干机进行冻干。干燥后的样品用傅立叶变换红外光谱仪(Thermo Scientific Nicolet IS50，美国)进行红外光谱分析。

采用溴化钾压片法，取干藻样1.5 mg与0.3 g干燥的KBr粉末一起研细，研磨充分后，将样品压成薄片后进行测定。

试验结果用 Excel 软件(2013 版)进行处理，再利用 SPSS 22.0 中的多因素方差分析(ANOVA)对测定项目的试验结果进行方差分析，Duncan’s 检验(<0.05)比较各处理间差异的显著性。

2 结果与分析

无氮 BG11 培养基预培养富集后，综合采用多种分离方法，获得固氮蓝藻的单种培养，最后经多种抗生素联合处理得到无菌藻株。纯化后藻丝形态见图1，由图1可知，在10×100倍镜下，藻丝长，藻细胞饱满，具异形胞，异形胞间生，从形态看属于念珠藻目藻株(该试验命名为藻D)。

图1 分离得到的一株具有异形胞的念珠藻Fig.1 A strain of nostoc with heterocysts isolated

对藻细胞16S rDNA和基因序列进行分析，通过Genebank进行Blast比较分析确定藻株所属的属。Blast比对结果见表1。根据16S rDNA序列Blast结果，藻D属于念珠藻属。而基因序列Blast结果表明藻D与sp.NIES-2111亲源关系最近，同源性达到97%。

表1 藻株的16S rDNA序列和rbcLX基因序列的Blast比对结果

对藻形态的影响。不同Cd浓度条件下生长的藻D的细胞形态如图2所示。由图2可知，在Cd浓度为0.200 mg/L时，藻丝开始断裂，并出现扭曲，在Cd浓度为0.600 mg/L时，念珠藻细胞被破坏的更加严重，且颜色变淡。

图2 不同Cd浓度下生长的藻D在显微镜下的微观形态Fig.2 Microscopic morphology of algae D grown under different Cd concentrations

对藻生长的影响。培养4 d后藻的OD测定结果见表2。由表2可知，低浓度Cd(0.025 mg/L)显著促进藻生长；0.050～0.100 mg/L没有显著毒害作用，超过0.200 mg/L时显著抑制藻生长，说明Cd对藻具有低促高抑的作用。通过抑制率与Cd浓度作图，按线性回归曲线计算可得出Cd对藻D的半致死浓度(EC)为0.205 mg/L，毒性较高。

表2 藻对镉耐受能力评估试验结果

由表3可知，在24 h时藻D对Cd的吸附可能已经达到平衡，此时Cd被藻D吸附的最多，随着时间的增加，有的藻已经死亡，然后又释放出部分Cd，所以Cd浓度增加。Cd初始浓度0.200 mg/L处理时，藻D在24 h对Cd的去除率达到最大(33.79%)。

表3 藻对Cd的去除效果

由图3可知，在0.200 mg/L镉的胁迫下，藻D的C—H(2 960～2 850 cm)、C==O(1 690～1 650 cm)和—NH(3 500～3 300 cm)等基团吸收峰明显比对照降低，推测镉与藻细胞中的部分基团结合。

图3 Cd对藻红外光谱的影响Fig.3 Effect of Cd on the infrared spectrum of algae

3 结论与讨论

已有研究表明，影响藻类吸附重金属离子的因素有很多，主要包括微藻浓度的大小、微藻本身的细胞结构、光照、温度、pH、盐度、重金属浓度、试验时间等。该试验中主要研究了重金属Cd的浓度为0.100和0.200 mg/L，试验时间为24和48 h的条件下，该藻对Cd的吸附能力，结果发现，当试验时间为24 h、Cd浓度为0.200 mg/L时，该念珠藻对Cd的去除能力最强，去除率达到33.79%。已有研究表明，斜生栅藻对Cd的吸收能力最高，单位吸收率可达76.9%。由此可见，该念珠藻对Cd的吸附能力相对较弱，今后应进一步分离纯化筛选Cd去除能力更强的藻株。

微藻对重金属的吸附是一个复杂的物化和生化过程，是多种机理共同协作的结果，主要包括络合机理和离子交换机理。藻类富含生化和矿物组分，尤其是一些官能团，如—OH、—COOH、—SH、—POO和—NH等在吸附过程中发挥很大的作用。根据该试验红外光谱数据显示，在0.200 mg/L镉的胁迫下，念珠藻D的C—H、C==O和—NH等基团吸收峰明显比对照降低，所以认为吸附过程还有其他官能团的参与，但是此次试验无法确定是哪些官能团，有待进行更深入的研究。现有研究表明，低浓度的Cd对藻的生长具有促进作用，高浓度的Cd具有抑制藻生长的作用。此次试验结果显示，低浓度Cd(0.025 mg/L)显著促进藻生长；0.050～0.100 mg/L没有显著毒害作用；超过0.200 mg/L时显著抑制藻生长，说明Cd对藻具有低促高抑的作用。

该研究用分子手段分析结果表明藻D与sp.NIES-2111亲源关系最近。Cd毒性试验结果Cd对藻D的EC值为0.205 mg/L，属于高毒性。在0.200 mg/L的Cd的胁迫下，藻D的C—H、C==O和—NH发生改变，说明该藻对Cd的去除能力相对较弱，今后应进一步分离纯化筛选对Cd去除能力更强的藻株。