HPLC法测定肾复康Ⅱ号胶囊中5个成分的含量Δ

尹继瑶，沈霞，胡静，崔小敏，任慧，曲彤，李宁，屈凯，3#a，陈志永，#b（.陕西中医药大学基础医学院，陕西 咸阳 7083；.陕西省中医药研究院，西安 70003；3.陕西省中医医院肾病二科，西安 70003）

肾复康Ⅱ号胶囊（陕药制字Z20130011）为陕西省中医医院的医疗机构制剂，由山茱萸、菟丝子、熟地黄、淫羊藿、金樱子、赤芍、丹参、黄芪、山药、王不留行、姜黄、醋鳖甲12味中药组成；其作为防治肾小球硬化的有效方剂，临床疗效显著[1－4]。方中山茱萸能壮元气，功专补阳固阴，菟丝子可温肾固精，二者共为君药；熟地黄能滋阴填髓，淫羊藿、金樱子可温肾壮阳，三者均能助君药补肾之力；丹参、赤芍、姜黄能活血化瘀、散体内凝滞之血，黄芪、山药可补益脾气以养肾，王不留行、醋鳖甲可活血通经而散结；诸药合用，共奏益肾散结之效。

本课题组的前期研究结果显示，肾复康Ⅱ号胶囊组方及拆方均可调节Notch信号通路相关蛋白表达，从而抑制肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cells，GMCs）的晚期凋亡，有效改善肾小球硬化症[3]；同时，其组方可抑制肾组织中纤溶酶原激活物抑制剂1和转化生长因子 β1的表达，从而对抗肾间质纤维化的发生[1，5－7]；此外，肾复康Ⅱ号胶囊亦可作用于肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）及其受体间质表皮转化因子（c-mesenchymal-epithelial transition factor，c-Met），调控间充质干细胞的旁分泌功能，起到改善肾功能的作用[8]。为提高肾复康Ⅱ号胶囊的质量控制水平，本研究选取该制剂中各组方药材在2020年版《中国药典》（一部）[9]中的质量控制成分，采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法测定山茱萸中的莫诺苷、马钱苷，赤芍中的芍药苷，丹参中的丹酚酸B和淫羊藿中的淫羊藿苷含量，首次建立了该制剂的含量测定方法，以期保障其临床使用的有效性和安全性。

1 材料

1.1 主要仪器

Agilent 1260系列HPLC仪系统（包括VWD检测器和Agilent Chem Station工作站）购自美国Agilent公司；KQ-100型超声波清洗机购自昆山超声仪器有限公司；BS210S型电子分析天平（d＝0.1 mg）、BT25S型电子分析天平（d＝0.01 mg）均购自北京赛多利斯天平有限公司。

1.2 主要药品与试剂

肾复康Ⅱ号胶囊由陕西省中医医院生产，规格为0.3 g×45粒/瓶，批号分别为20201101、20201110、20210724、20210929、20211013。莫诺苷对照品（批号P11M11F2846，纯度≥98.0%）、马钱苷对照品（批号P24O11F128801，纯度≥98.0%）、丹酚酸B对照品（批号P13N11F130912，纯度≥98.0%）均购自上海源叶生物科技有限公司；芍药苷对照品（批号MUST-17031901，纯度≥99.3%）购自成都曼斯特生物科技有限公司；淫羊藿苷对照品（批号0737-200111，纯度≥98.0%）购自中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯）购自美国Thermo Fisher Scientific公司。其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Agilent 5 TC-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～20 min，10%A→20%A；20～30 min，20%A→30%A；30～40 min，30%A→40%A）；柱温为30 ℃；流速为1 mL/min；检测波长为240 nm；进样量为10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 精密称取莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹酚酸B、淫羊藿苷对照品各适量，置于10 mL容量瓶中，加80%甲醇稀释并定容，即得含莫诺苷0.240 mg/mL、马钱苷0.242 mg/mL、芍药苷0.350 mg/mL、丹酚酸B 0.236 mg/mL、淫羊藿苷0.259 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取肾复康Ⅱ号胶囊内容物，研细，精密称取0.5 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，按料液比1∶100（g/mL）加80%甲醇50 mL使之溶解，称定质量；超声（频率40 kHz，功率300 W）处理30 min，冷却至室温，再称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀；经0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 按照处方制剂工艺，分别制得缺山茱萸、缺赤芍、缺丹参和缺淫羊藿的阴性样品，再分别按“2.2.2”项下方法制备各阴性样品溶液。

2.3 系统适用性试验

取上述供试品溶液、混合对照品溶液和阴性样品溶液各10 μL，注入HPLC仪，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图（图1）。由图1可知，肾复康Ⅱ号胶囊中莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹酚酸B、淫羊藿苷均能达到有效分离，理论板数分别为20 522、52 856、55 345、347 545、259 194，分离度分别为1.63、1.72、2.80、2.77、2.69，阴性样品无干扰，表明该方法系统适用性良好。

图1 肾复康Ⅱ号胶囊中5个成分的HPLC图

2.4 线性关系、定量限和检测限考察

精密量取上述混合对照品溶液0.2、0.5、1、2、5、10 mL，用80%甲醇分别定容至10 mL容量瓶中，再按“2.1”项下色谱条件进样10 μL，记录峰面积。以对照品的质量浓度为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得到5个成分的回归方程、相关系数（r）和线性范围，结果见表1。再以信噪比10∶1、3∶1分别计算定量限和检测限，求得莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹酚酸B和淫羊藿苷的定量限分别为0.166、0.198、0.877、0.220、0.260 μg/mL，检测限分别为0.056、0.066、0.292、0.073、0.086 μg/mL。

表1 5个成分的线性回归考察结果

2.5 精密度考察

取混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录各成分峰面积。结果显示，莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹酚酸B和淫羊藿苷峰面积的RSD分别为0.42%、0.54%、1.62%、0.38%和0.23%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性考察

取同一批肾复康Ⅱ号胶囊（批号20201101）制备的供试品溶液，室温存放，分别于0、2、4、8、12、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录各成分峰面积。结果显示，莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹酚酸B和淫羊藿苷峰面积的RSD分别为0.65%、2.03%、0.62%、0.36%和2.36%（n＝6），表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定性良好。

2.7 重复性考察

取同一批肾复康Ⅱ号胶囊（批号20201101），共6份，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录各成分峰面积，以外标法计算样品中5个成分的含量。结果显示，莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹酚酸B和淫羊藿苷含量的RSD分别为1.66%、2.36%、1.09%、0.17%和1.45%（n＝6），表明该方法重复性良好。

2.8 准确度考察

精密称取莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹酚酸B和淫羊藿苷对照品各适量，加80%甲醇溶解并稀释，制成上述5个成分质量浓度依次为1.000、0.816、2.984、2.860、0.616 mg/mL的单一对照品溶液。精密称取已知5个成分含量的肾复康Ⅱ号胶囊（批号20201101）内容物约0.25 g，共6份，精密加入各单一对照品溶液，再按“2.2.2”项下方法制成供试品溶液后，按“2.1”项下色谱条件进样分析，计算各成分的平均加样回收率，结果表明方法准确度良好，详见表2。

2.9 样品含量测定

取5批肾复康Ⅱ号胶囊，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录各成分峰面积，以外标法计算样品中5个成分的含量，每批样品平行测定3次，结果见表3。

表3 莫诺苷等5个成分的含量测定结果（mg/g，n＝3）

3 讨论

3.1 指标成分的选取

现代药理研究证实，山茱萸中的莫诺苷可通过晚期糖基化终末产物（advanced glycosylation end products，AGEs）-AGE受体（receptor of AGE，RAGE）信号通路抑制RAGE、核因子κB蛋白和丝裂原激活蛋白激酶的表达，减轻氧化应激损伤，从而起到对肾损伤的改善作用[10]；山茱萸中的马钱苷可有效调节AGEs诱导GMCs产生的内质网应激，减轻炎症反应，抑制氧化应激，从而改善肾功能[11－12]；赤芍中的芍药苷可以通过抑制硫氧还蛋白结合蛋白的表达而拮抗氧化应激对GMCs的损伤，从而发挥肾脏保护作用[13－14]；丹参中的丹酚酸B可通过抗糖[15]、抗炎[16]、控制氧化应激[17]等途径减轻肾功能损伤；淫羊藿中的淫羊藿苷可通过免疫调节等作用改善肾功能[18]。以上5个成分均有良好的肾脏保护作用，且均为2020年版《中国药典》（一部）中各药材的质量控制成分[9]，因此，本研究选取其作为肾复康Ⅱ号胶囊的质量控制指标成分。

3.2 供试品溶液制备方法的考察

为优化供试品溶液的制备方法，本研究分别考察了提取溶剂（乙醇、甲醇、20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、80%甲醇）、提取方式（超声提取、加热回流提取）、提取时间（15、30、45 min）、料液比（1∶50、1∶100、1∶150，g/mL）、提取次数（1、2、3次）对提取效果的影响，最终确定的制备方法为：以80%甲醇为提取溶剂，料液比为1∶100（g/mL），超声提取1次，提取30 min。

3.3 色谱柱和流动相等色谱条件的考察

本研究考察了月旭XB-C18、Agilent 5 TC-C18这2种色谱柱对指标成分峰形的影响，结果发现，利用这2种色谱柱所得5个成分的峰形相近，即两者均可用于肾复康Ⅱ号胶囊的含量测定。同时，还考察了不同柱温（25、30、35℃）对5个成分分离度的影响，结果发现，5个成分在30℃时的分离效果最佳，故最终选择Agilent 5 TC-C18色谱柱，并将柱温设置为30℃。

本研究考察了甲醇-磷酸溶液、甲醇-甲酸溶液、乙腈-磷酸溶液、乙腈-甲酸溶液等流动相系统，并考察了不同浓度（0.1%、0.3%）的甲酸、磷酸对5个成分分离度的影响。结果显示，采用乙腈作为流动相系统时，色谱峰基线较平稳、分离度较好；甲酸和磷酸的浓度对最终的分离效果影响不大，但磷酸的分离度优于甲酸，故最终选择乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相。

3.4 检测波长的选择

由2020年版《中国药典》（一部）[9]及相关文献可知，上述5个成分的最佳检测波长不同，最大吸收在230～270 nm之间。本研究考察了230～270 nm之间不同波长（230、240、260、270 nm）下各成分的出峰情况，结果发现在240 nm波长下各成分分离度较高、峰形较好，故以240 nm为检测波长。

综上，本研究选取了肾复康Ⅱ号胶囊中含量较高且与其临床药效紧密相关的5个成分作为指标成分，首次建立了该制剂的多指标含量测定方法。该方法简便、准确、重复性好，有助于提升肾复康Ⅱ号胶囊的质量控制水平，保证其临床应用的有效性和安全性。