不同林龄顶坛花椒林地土壤微生物浓度与生物量化学计量特征

2022-08-10喻阳华吴银菇宋燕平李一彤

生态环境学报 2022年6期

喻阳华，吴银菇，宋燕平，李一彤

1.贵州师范大学喀斯特研究院/国家喀斯特石漠化防治工程技术研究中心，贵州贵阳 550001；2.贵州师范大学地理与环境科学学院，贵州贵阳 550025

中国西南喀斯特区受亚热带季风气候和人为活动影响，造成土壤侵蚀严重、土壤生产力降低，导致石漠化发育，生态修复成为必然趋势（Wang et al.，2004；万军，003）。顶坛花椒（Zanthoxylum planispinumvar.dintanensis）为竹叶椒（Zanthoxylum planispinum）的一个变种，喜钙、耐旱，水土保持性能较好，在石漠化治理和生态系统恢复过程中价值突出。贞丰-关岭花江片区自1992年起大规模种植顶坛花椒，形成了独具特色的人工林，在土壤生态系统修复和山区生态治理中发挥了显著作用（龙健等，2012）。但随生长年限增加，出现了挂果期与轮伐周期缩短、产量下降，以及土壤养分贫瘠和质量退化等问题。

土壤微生物是土壤的重要组成部分，成为连接土壤与植物的桥梁（Devi et al.，2006；Leff et al.，2015），其生物量（SMB）能够指示生态系统功能的变化，被用来评价土壤质量和反映微生物群落状态的变化（He et al.，2003）。生态化学计量学是研究生态系统能量与多重化学元素平衡的科学，是探索不同生态系统组成之间相互联系与内在机制的重要方法，被广泛应用于微生物驱动生态过程的研究（Buchkowski et al.，2015；Zhu et al.，2021）。土壤微生物化学计量较元素化学计量能更好地表征土壤养分需求程度和资源利用策略，指示植物N、P供给的限制状况（Cleveland et al.，2007；李万年等，2020）。林龄能够改变物种组成、群落结构和林内小气候生境（Zhong et al.，2020），由林龄引起的林分和土壤环境变化能够间接影响土壤微生物参与养分循环（杨凯等，2009；范媛媛等，2019）。相关研究表明，同种植物不同林龄的土壤微生物群落、SMB具有差异（Adair et al.，2013；Zhu et al.，2021）；牛小云等（2015）研究显示，土壤微生物群落随落叶松（Larixkaempferi）林龄增加呈降低趋势；Zhang et al.（2018）研究发现，随油松（Pinustabulaeformis）林龄增加土壤 SMB逐渐升高；而Taylor et al.（2007）研究表明，随红云杉（Picea rubens）林龄增加SMB变化不显著，导致该结果的原因与林分类型、林龄跨度和环境条件有关。目前关于林龄与土壤微生物化学计量关系的研究多集中在森林演替、植被恢复和不同林型等方面（Xiao et al.，2021；刘宝等，2019；胡宗达等，2021），对同种植物不同林龄土壤微生物化学计量特征研究较少，土壤性质与微生物化学计量的关联尚不明确。因此，本文研究土壤微生物化学计量随林龄的变化特征，探明土壤微生物化学计量间的互作效应，以及对土壤因子的响应，有利于剖析土壤微生物化学计量与林龄的内在关系，以期为顶坛花椒人工林土壤质量评价、可持续经营管理等提供科学支撑。

基于此，以 5—7、10—12、20—22、28—32 a顶坛花椒人工林的表层土壤（0—20 cm）为对象，测定土壤微生物浓度、SMB，旨在阐明土壤微生物浓度、SMB及其化学计量比随林龄的变化规律，厘清土壤微生物浓度、SMB及其化学计量比之间的互作效应，揭示土壤主要化学性质对其微生物化学计量变化的影响效应。通过全面掌握土壤质量状况，为顶坛花椒人工林高效经营和管理措施制订提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究区位于贵州省关岭县花江镇坝山村一带，为中国典型的喀斯特高原峡谷地貌，海拔约 530—1473 m。属亚热带季风气候，年均降水量约 1100 mm，集中在5—10月，约占全年降水的83%，全年无霜期337 d；年均温18.4 ℃，极端最高、低温依次为 32.4、6.6 ℃。土壤以石灰岩为母质的石灰土为主，基岩裸露面积在 70%以上（Zou et al.，2019）。顶坛花椒采用幼苗移栽，期间依据林龄、树冠和物候等特征进行经营管理，目前已成为该区相对稳定、种植面积最大的人工经济林，另有核桃（Caryacathayensis）、玉米（Zeamays）、金银花（Lonicerajaponica）、香椿（Toonasinensis）、李（Prunussalicina）、山豆根（Sophoratonkinensis）和柚木（Tectonagrandis）等伴生种。

1.2 土壤采集与处理

2020年7月，采用空间代替时间的方法，选择立地因子基本一致的顶坛花椒人工林初始挂果期、旺盛挂果期、终止挂果期和衰老死亡期设置调查样地（中心坐标：海拔 621 m，105°40′28.33″E、25°37′57.41″N），依次记为 YD1—YD4，由于顶坛花椒存在补植、补种等情形，因此林龄为区间值。4个龄级的林分均设置3个10 m×10 m的样地（表 1），每个样地内，距离树干基部 30—50 cm范围内（通常施肥范围的10—30 cm区域），按照S型选取5个样点，采集0—20 cm土壤制成混合样，“四分法”保留鲜重约500 g，4个龄级共采集土样12份。将土样放置在无菌袋内，立即带回实验室。

表1 样地基本情况Table 1 Basic information of sampling plots

所有样品人工去除石块、根系和动植物残体后，过2 mm筛。筛出的样品分成2份，其中1份放入冰箱于4 ℃下保存，于7日内完成土壤微生物浓度、SMB测定。另外1份自然风干后，研钵粉碎通过0.25 mm筛，用于测定土壤化学性质。

1.3 测试指标与方法

1.3.1 土壤微生物浓度测定

使用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基培养细菌，在30 ℃培养箱中培养24 h后计数。使用马丁-孟加拉红培养基培养真菌，在25 ℃培养箱中培养72 h后计数。使用高氏 1号琼脂培养基培养放线菌，在28 ℃培养箱中培养96 h后计数。细菌、放线菌采用平板计数法计数，真菌采用倒皿法计数（林先贵，2017；李雪萍等，2017）。

1.3.2 土壤微生物生物量测定

土样先用氯仿薰蒸法进行处理，然后用 0.5 mol·L-1K2SO4溶液提取液，依次采用重铬酸钾硫酸外加热法测定MBC、凯氏定氮法测定MBN；用0.5 mol·L-1NaHCO3溶液提取液，采用钼蓝比色法测定MBP，计算公式参照文献（王理德等，2016）。

1.3.3 土壤化学性质测定

土壤有机碳（SOC）采用重铬酸钾外加热法测定；全氮（TN）采用凯氏定氮法测定；全磷（TP）采用硫酸高氯酸氧化法测定；TK采用氢氟酸-硝酸-高氯酸消解-火焰光度计法测定；速效氮（AN）采用碱解扩散法测定；速效磷（AP）采用氟化铵-盐酸浸提-钼锑抗比色-紫外分光光度法测定；AK采用中性乙酸铵溶液浸提-火焰光度计法测定；pH采用电极电位法（鲍士旦，2000）测定，结果见表2。

表2 不同林龄顶坛花椒的土壤化学性质Table 2 Soil chemical properties in Zanthoxylum planispinum var.dintanensis of different forest ages

1.4 统计分析

应用Microsoft Excel 2010、SPSS 20.0进行数据整理与统计分析。数据正态分布检验采用Kolmogorov-Smirnov法。满足正态分布时，采用单因素方差分析（One-way AVOVE）和最小显著差异法（Least significant difference，LSD）进行检验；不满足时，采用Dunett’s T3法进行检验。土壤微生物因子间的相关性分析采用 Pearson相关性分析法。应用Origin 8.6制图，R语言corrplot包绘制土壤参数相关热性图，Canoco 5.0进行土壤微生物化学计量与化学性质的冗余分析（redundancy analysis，RDA）。数据表达形式均为平均值±标准差，显著与极显著水平为P=0.05、0.01。

2 结果与分析

2.1 不同林龄土壤微生物浓度与生物量

土壤细菌、真菌和放线菌浓度分别为3.3×105—7.9×105、2.10×103—4.15×103、2.20×105—3.95×105CFU·g-1，表现为细菌>放线菌>真菌；土壤MBC、MBN和MBP质量分数依次为322.5—386.0、13.05—26.15、52.60—334.50 mg·kg-1，为MBC>MBP>MBN。土壤真菌浓度随顶坛花椒林龄增加逐渐增大，细菌、放线菌浓度无显著差异（P>0.05，下同），但数值上呈降低趋势；土壤MBC随顶坛花椒林龄增加未见显著差异；MBN则先升高后降低，在YD3达到最高；MBP以YD4显著低于其他3个样地（P<0.05，下同）。除土壤真菌浓度、MBN、MBP外，细菌和放线菌浓度，以及MBC随林龄增加均未发生显著变化，表明林龄对同种植物土壤微生物浓度和SMB的影响规律不完全一致（图1）。

图1 不同林龄土壤微生物浓度、生物量Figure 1 The soil microbial concentration and biomass of different forest ages

2.2 不同林龄土壤微生物浓度与生物量化学计量特征

土壤细菌/真菌、真菌/放线菌变幅分别为0.80—3.70、0.54—1.89，随顶坛花椒林龄增加，土壤细菌/真菌逐渐降低，真菌/放线菌则逐渐升高；土壤细菌/放线菌为1.38—2.39，随林龄增长无显著差异，数值上 YD1和 YD3略高于 YD2和 YD4。土壤MBC/MBN变化为12.90—29.58，在4个龄级间差异显著，其中 YD1最高，YD3最低；土壤MBC/MBP、MBN/MBP依次为1.09—2.55、0.04—0.39，均以YD4为最高，与其他3个样地存在显著差异，随林龄变化趋势一致，表明土壤MBC、MBN较稳定（图2）。

图2 不同林龄土壤微生物浓度、生物量计量特征Figure 2 The measurement ratio of soil microbial concentration and biomass of different forest ages

2.3 土壤微生物浓度、生物量及其化学计量之间的相关性

土壤BAC与BAC/FUN、BAC/ACT为极显著正相关（0.858、0.919），MBP与 MBC/MBP、MBN/MBP表现出显著负相关（-0.810、-0.787），BAC/FUN与FUN/ACT、MBC/MBN呈显著负相关、极显著正相关（-0787、0.857）。土壤 ACT 与BAC/FUN是显著正相关关系（0.801），暗示ACT与 BAC/FUN之间可以相互促进；土壤 MBN与MBC/MBN呈极显著反向效应（-0.927），表明MBC/MBN受到 MBN的抑制；MBC/MBP与MBN/MBP之间呈极显著增强效应（0.991），说明两者间存在一定的协调性；土壤FUN/ACT与MBC的负相关性（-0.828）大于FUN/ACT与MBC/MBN的相关性（-0.780），表明MBC对FUN/ACT的反向作用更强。土壤微生物浓度与 SMB之间均无显著相关性，土壤FUN与其他指标均无相关关系，说明土壤FUN稳定性相对较强，且土壤微生物浓度和SMB之间的相关性小于其化学计量比（图3，表3）。

表3 土壤微生物浓度、生物量及其化学计量比之间相关系数Table 3 Pearson’s correlation coefficients of soil microbial concentration, biomass and their stochiometric ratios

图3 土壤微生物浓度、生物量及其化学计量比之间的相关热图Figure 3 Correlation heat map among concentration,biomass and stoichiometric ratio of soil microorganisms

2.4 土壤化学性质对土壤微生物化学计量的影响

对顶坛花椒人工林土壤微生物化学计量（实心箭头）与土壤化学性质（空心箭头）进行冗余分析，结果显示，土壤主要化学性质对化学计量的解释率为99.78%（表4），AK、TK、SOC、pH、AP对土壤微生物化学计量的影响相对较大，其中AK呈显著相关（表5）。土壤AK与MBP、MBC、BAC/FUN、ACT、MBC和MBC/MBN呈正相关，与FUN/ACT、MBN/MBP、MBC/MBP呈负相关；pH、SOC、TK与MBC、MBC/MBN呈正相关，与MBN则呈负相关；TP与MBN呈正相关，与MBC、MBC/MBN呈负相关。其他土壤化学性质与土壤微生物化学计量的相关性较弱（图4）。

图4 土壤微生物化学计量与土壤化学性质的冗余分析Figure 4 Redundancy analysis of soil microbial stoichiometry and soil chemical properties

表4 RDA分析的特征值、方差贡献率及累计方差贡献率Table 4 Eigenvalues, and their contribution to the variance of RDA

表5 部分土壤化学性质重要性测序和显著性检验Table 5 Sequencing and remarkable test of portion soil chemical factors

3 讨论

3.1 土壤微生物浓度及其化学计量随林龄的变化

土壤微生物能够表征土壤生态系统的稳定性，是最具潜力的敏感性生物指标之一（Cao et al.，2010；Xu et al.，2010），研究土壤微生物群落的化学计量特征，能较好地阐明土壤养分与质量动态变化规律（Wu et al.，2015；赵辉等，2020）。该文显示，顶坛花椒人工林土壤细菌、真菌与放线菌具有差异，但总体上表现为细菌>放线菌>真菌，原因是喀斯特地区土壤多为中、碱性；同时样品采于夏季，植物生长自身分泌的糖和淀粉为细菌提供食物来源（Krajick，2006），有利于细菌生长繁殖，但不利真菌生长，从而导致细菌浓度显著高于真菌。各个龄级之间土壤微生物浓度均表现为细菌>放线菌>真菌，与总体微生物浓度变化趋势一致，与王理德等（2016）研究结果相符，可能是林龄、土壤因子与小生境气候等能够改变局部土壤微生物群落，但整体上波动程度很小，优势菌群仍是细菌，原因是石漠化过程常伴随着强烈水土流失，带走部分养分，导致土壤贫瘠（He et al.，2009；刘方等，2005），土壤微生物获取资源途径与总量受限，将更多的养分投入群落构建，维持微生物群落的稳定生长；其次与微生物自身具有一定的内稳性有关（Li et al.，2012；Song et al.，2019）。

细菌、真菌与放线菌是土壤微生物“三大菌”，占据有一定的生态位，可促进土壤生态系统 C、N周转与能量循环，以及酶和有机酸等产生（Imberger et al.，2001），定量微生物的化学计量特征，能够指示土壤质量。Ramos et al.（2003）研究表明，土壤FUB/ACT升高是土壤质量退化的标志，顶坛花椒生长初期FUB/ACT显著低于后期（图2C），说明其土壤质量随生长年限增加而降低。究其原因，生长前期挂果旺盛，产量更高，植株生长需大量养分，人工施肥补给土壤养分以维持植株正常生长；生长后期挂果量大幅降低，开始进入衰老期，人为施肥停止，且有部分养分被果实带走，管理更为粗放；其次，长期使用化肥导致土壤板结，影响土壤活性，凋落物分解归还的那一部分养分仅能维持植物存活，从而导致土壤质量降低。土壤细菌/真菌（BAC/FUN）能够表征木质素、纤维素的含量，通常呈正相关关系（Imberger et al.，2001）。随林龄增加，该文土壤BAC/FUN呈降低趋势，说明木质素和纤维素含量逐渐减小，原因可能是不同微生物类群的代谢方式和对底物的需求存在差异（Mitchell et al.，2013；Wang et al.，2013），生长后期土壤质量下降，细菌群落生长受到抑制，真菌数量有明显上升趋势（图1A、B）。然而，本文未测定土壤中木质素、纤维素的含量，今后还需深入探讨。Boyle et al.（2008）研究表明BAC/FUN可表征土壤生态系统的稳定性。该区BAC/FUN随林龄增加逐渐减小，理论上顶坛花椒人工林土壤生态系统一定程度上朝稳定方向发展，但与林分衰退、土壤质量降低的事实不符，表明不同指标之间存在权衡关系，具体原因仍需深入研究。

3.2 土壤微生物生物量及其化学计量随林龄的变化

土壤微生物 SMB是土壤矿质养分和有机质转化和循环的动力，在植物营养和土壤肥力中作用显著。本文中，土壤 MBC、MBN（352.3、18.7 mg·kg-1）显著低于全球（680.4、105.0 mg·kg-1）平均水平，究其原因是，受长期施肥、翻耕和短轮伐期等人为活动影响，人工林土壤扰动频繁，进而影响土壤微生物类群结构，不利于微生物生长与繁殖；土壤MBP（246.7 mg·kg-1）显著高于全球（40.3 mg·kg-1）平均水平，说明生态系统受P限制的可能性较低，与喀斯特地区整体P亏缺的背景不一致，这可能与P肥施用有关，也可能受研究尺度制约，但具体原因尚需深入探明。不同生长阶段林分结构、土壤底物、微生物群落结构和凋落物回归量等存在差异，导致土壤SMB各异。该文土壤MBC在4个龄级间差异不显著，说明土壤MBC较为稳定，林龄对土壤MBC转化和迁移影响很小。土壤MBN随林龄增加先逐渐升高后降低（图1E），与王雪梅等（2017）结果相反，原因可能是受气候、土壤、降水以及地表植被类型等因素的综合影响。28—32年的土壤MBP显著低于其他3个龄级（图1F），说明长期施肥、除草剂使用等抑制了微生物的活性与生长繁殖，在不同龄级间土壤TP含量无显著差异（表2），低微生物活性对土壤P活化效率小，进而影响土壤MBP。

土壤微生物生物量C∶N∶P化学计量是微生物活动方向和凋落物分解过程养分释放与否的决定性因素（Heuck et al.，2015），影响土壤养分的有效性。全球土壤MBC/MBP、MNC/MBN与MBN/MBP依次为 59.5、3—24 和 1—55（Cleveland et al.，2007），该区仅有MNC/MBN（12.9—29.58）在全球数据范围内，MBC/MBP（1.09—6.64）、MBN/MBP（0.04—0.39）均低于全球范围，说明该区土壤养分相对亏缺，原因是顶坛花椒为经济植物，果实采摘带有部分养分，加之该区强烈的岩溶作用导致养分大量流失。土壤 MBC/MBN可作为微生物群落变化的指标，一般MBC/MBN为3—5时，细菌为优势菌落，其值为4—15时，真菌为优势菌群（Paul et al.，1996；Zhou et al.，2015）。本研究中，土壤MBC/MBN在4个龄级间差异显著，仅有 20—22年人工林土壤MBC/MBN（12.90±0.45）在该范围内，其他均高于该值域，与土壤MBC/MBN越高，真菌生物量越多的结论不符（图1E，图2D），说明顶坛花椒林龄改变后，土壤微生物群落结构发生了局部转变，但优势菌群未改变，这佐证了该区微生物将更多养分投入到群落构建的观点。推测与前人结论不符的原因是，不同研究尺度、土壤因子和人为干扰程度等均会影响土壤微生物群落结构及活性，但最重要的具体潜在驱动因素仍有待分析。

3.3 土壤微生物化学计量间的相关性及其影响因素

该区土壤微生物浓度、SMB化学计量间均不存在相关性，除土壤FUN外，微生物浓度、SMB化学计量及两者之间均有着一定的相关性（表 3），这与微生物的内稳定性有关。洪丕征等（2016）研究发现，红椎（Castanopsishystrix）和格木（Erythophleumfordii）人工林幼龄期土壤 FUN 与MBC显著正相关、BAC/FUN与MBC/MBN无显著相关，本文结果与之相反，表明植被类型、林龄等会影响微生物群落结构，以同步响应土壤状况。

该区YD1的土壤pH更高，其细菌浓度较高、真菌浓度较低，而YD3则反之（表1，图1A、B），且RDA分析显示pH与细菌正相关、与真菌负相关（图4），说明pH一定程度上能够影响微生物群落结构，这一结论已被证实（Hǒgberg et al.，2007；Fenández-Calvino et al.，2010；Cao et al.，2010）。土壤SOC、TK与MBC正相关，与MBN、MBP负相关，TP与MBN、MBP正相关，与MBC负相关，说明土壤养分对微生物SMB存在促进或抑制效应，原因是土壤养分能够调控微生物群落结构，微生物吸收养分时受土壤养分条件剧烈影响（Zhang et al.，2020；王传杰等，2018），这表明土壤微生物在一定程度上依赖土壤养分。除土壤MBC/MBN外，土壤SOC、TK、TP与MBC/MBP、MBN/MBP间相关性较弱，可见顶坛花椒人工林土壤 SMB计量比对土壤养分的依赖程度相对较小，能够保持一定的自稳定性。土壤微生物化学计量与AK显著相关（图4），这可能是土壤微生物中解 K菌活化土壤 AK（王薪琪等，2017），推测该区细菌的主要菌种之一可能是解K菌。该文未测定“三大菌”的具体种类，今后应当予以加强。

林龄驱动土壤性质发生动态变化，通过改变土壤微生物群落结构与活性，从而影响微生物的化学计量特征。本研究得出，TK、AK和pH等是调节土壤微生物群落的主要因子，合理施加K肥和调节土壤pH值，是顶坛花椒人工林经营管理的关键措施之一，且缓效态和速效态养分的功能均应得到重视；提供优势微生物类群生长与繁殖所需的营养物质，满足所需的底物，是人工林培育的关键环节。研究结果对指导顶坛花椒人工林土壤养分管理，具有一定的理论和实践价值。