血清GFAP水平与NBNA评分在新生儿HIE中的临床价值

尹绪凤，陈少军，李文斌

1.湖北医药学院附属国药东风总医院儿科，湖北十堰 442000；2.华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科，湖北武汉 430030

新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)是指在围生期因各种因素导致窒息，进而引起胎儿或新生儿缺氧缺血性脑损伤[1]。多数学者认为新生儿HIE发病机制复杂，通常是多种机制相互作用导致的病理结果，主要包含因脑血流量降低、脑组织供氧不足继而引发氧化应激反应、大脑兴奋性氨基酸释放、炎症相关因子释放、血脑屏障破坏等[2-3]。相关数据显示，我国HIE的发病率为3‰～6‰，15%～20%的HIE患儿在新生儿期发生死亡，25%～30%的HIE患儿则出现严重、永久、不可逆性的神经功能障碍[4]。

HIE患儿的临床症状是其主要诊断依据，对其进行临床评估通常采用的是北京协和医院鲍秀兰教授提出的20项新生儿行为神经测定(NBNA)评分。该评分法结合了美国Brazelton新生儿行为测定和法国Ameil-Tison神经运动测定方法的优点，具有可操作性强、可信度高、灵敏度及特异度高的优点[5-6]。

目前HIE辅助检查主要包括颅脑彩超、头颅CT、核磁共振、脑电图等，但是越来越多临床研究发现，神经损伤标志物水平可预测神经系统是否存在病理损伤[7-9]，现已成为医学研究热点。神经损伤标志物大多是与神经组织密切相关的生物蛋白，当神经系统受到一定程度损伤时，此类生物蛋白将会发生特异性改变，常见神经损伤标志物有S100钙结合蛋白B(S100B)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、泛素羧基末端水解酶L1(UCHL-1)和髓鞘碱性蛋白(MBP)、胶原纤维酸性蛋白(GFAP)等。GFAP是星形胶质细胞特异性细胞骨架蛋白，正常情况下，GFAP在细胞内或细胞外自发降解，通过脑脊液循环于脑室系统与脊髓中，血中GFAP水平较稳定；当脑部发生损伤后，星形胶质细胞大量增生导致GFAP表达增加，GFAP通过血脑屏障进入血液中，使得血中GFAP水平上调[10]。故本研究对不同病情严重程度、不同日龄足月HIE患儿的血清GFAP水平、NBNA评分情况及二者之间的相关性进行分析，以期对HIE患儿的早期诊断、病情严重程度、预后判断以及指导临床治疗提供一定理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年1月至2019年12月湖北医药学院附属国药东风总医院收治的90例诊断为HIE的新生儿作为HIE组，依据病情严重程度将患儿分为轻度组(40例)、中度组(28例)、重度组(22例)，并随机选取同时期产科70例健康足月新生儿作为本临床试验对照组。本研究经湖北医药学院附属国药东风总医院伦理委员会批准，各研究对象家属均已签署临床试验知情同意书。

1.2纳入标准 HIE组纳入标准：(1)所有患儿均为足月儿(胎龄37～42周)；(2)出生体质量2.5～4.0 kg；(3)患儿均符合2005年中华医学会儿科学分会新生儿组制订的HIE临床诊断及分度标准[11]。对照组纳入标准：(1)胎龄37～42周；(2)出生体质量2.5～4.0 kg；(3)有正常的Apgar评分；(4)孕母在妊娠期身体健康；(5)新生儿无先天畸形、窒息史及神经系统病症等表现。

1.3方法

1.3.1标本采集及GFAP检测 所有纳入本研究的新生儿在日龄1、3、7 d时分别采集外周静脉血2～3 mL。将采集的血液标本静置5～10 min后离心，设置离心机转速为3 000 r/min，离心时间为10 min，离心后取上清液，置于-80 ℃冰箱保存待测。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清GFAP水平，人GFAP ELISA试剂盒(ab223867)由上海艾博抗公司提供。用已知浓度的GFAP抗体包被微孔酶标板，制成相对抗体，向包被单抗的微孔酶标板中依次加入待检测血清标本、标准品，待检测标本中的人GFAP与生物素和亲和素相结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经彻底洗涤后加显色底物四甲基联苯胺(TMB)显色。TMB在辣根过氧化物酶的催化下转化成蓝色，在终止液的作用下最终转化为黄色。颜色的深浅与待测标本中GFAP水平呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度值，通过标准曲线计算样本中GFAP水平。

1.3.2NBNA评分 分别在新生儿日龄3、7 d时进行NBNA评分。NBNA评分内容包括新生儿行为能力、主动肌张力、被动肌张力、原始反射、一般评估5个部分共20项，以上每项评分有3个分度(0、1、2分)，总分0～40分，评分>35分为合格，评分≤35分则记为不合格，提示有脑损伤。

1.3.3资料收集 收集所有受试新生儿胎龄、出生体质量、性别、分娩方式等一般资料。

2 结 果

2.1各组一般资料比较 HIE各亚组和对照组间胎龄、出生体质量、性别比例、分娩方式比例比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组一般资料比较

2.2各组血清GFAP水平比较 同一时间点各组间血清GAFP水平差异均有统计学意义(P<0.05)，其中：日龄1、3 d时HIE各亚组均明显高于对照组，日龄7 d时中、重度组高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.01)；同一时间点HIE各亚组间两两比较比较，日龄1 d时重度组高于轻、中度组，日龄3 d、7 d时中、重度组高于轻度组且重度组高于中度组，差异均有统计学意义(P<0.016 7)。HIE各亚组不同时间点血清GAFP水平比较：轻度组日龄3 d时较日龄1 d时明显上升，日龄7 d时较日龄1、3 d时均有所下降，差异具有统计学意义(P<0.05)；中、重度组日龄3、7 d时较日龄1 d时明显上升，日龄7 d时较日龄3 d时有所下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2、图1。

图1 各组新生儿血清GFAP水平变化趋势图

表2 各组间及不同时间点血清GFAP水平比较

2.3各组NBNA评分比较 日龄3 d时HIE各亚组NBNA评分均明显低于对照组，日龄7 d时中、重度组明显低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.01)，而轻度组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)；同一时间点HIE各亚组两两比较，日龄3、7 d时轻、中、重度组NBNA评分依次呈递减趋势，差异均有统计学意义(P<0.016 7)；日龄7 d时，HIE各亚组NBNA评分均较日龄3 d时升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组日龄3、7 d时NBNA评分比较分)

2.4日龄3、7 d时的HIE组血清GFAP水平与NBNA评分的相关性分析 Pearson相关分析显示，日龄3、7 d时，HIE组血清GFAP水平与NBNA评分均呈负相关(r=-0.671、-0.825，P<0.01)。见图2。

注：A、B分别为日龄3、7 d时HIE组血清GFAP水平与NBNA评分间关系散点图。

3 讨 论

HIE与感染性脑损伤、胆红素脑病并称为新生儿三大脑损伤疾病[12]。HIE发病机制复杂，是多种机制与途径共同导致的急性或慢性脑损伤。HIE可发生在围生期任何阶段，分娩前、分娩时、分娩后的多种因素均可导致缺氧缺血性脑损伤[13-14]。而HIE新生儿的干预时机十分重要，临床医生需要早期发现其行为神经异常表现。因此，新生儿行为神经检查是近20年来国际儿科领域重要进展及研究重点之一。通过对新生儿行为神经进行合理评估，可以全面、完善、精细地评估新生儿的精神状态、行为能力和各种神经反射。目前我国通常采用北京协和医院鲍秀兰教授制订的NBNA评分法。相对于其他行为神经评估法而言，NBNA评分简单，培训时间短，检查时间仅需10 min，具有可操作性强，可反复测定，无痛苦，以及无伤害等特点，其结果可靠，灵敏度及特异度高。另一方面，NBNA评分是基于中国新生儿制订，能更加全面地评价新生儿的行为能力，也是我国临床上目前使用最为广泛的一种新生儿行为神经评定方法。

随着分子生物学快速发展，分子生物学病理诊断对早期发现病变有重要意义。疾病早期，血清标志物的出现往往早于组织学病变[15]，因此，在疾病早期加强对血清标志物检测，有利于更早发现异常，进而弥补目前传统辅助检查的缺陷与不足。基于此，神经损伤标志物在临床上对HIE患儿早期诊断具有指导意义。现今为止，已有超过120种血清神经损伤标志生物蛋白被具体描述[16]，临床研究较多的神经损伤标志物主要包括GFAP、NSE、S100B、UCHL-1、MBP等。其中，GFAP是星形胶质细胞中的一种细胞骨架蛋白，在神经再生和维持星形胶质细胞形态功能正常具有重要作用[17]。星形胶质细胞神经元与毛细血管壁共同组成了中枢神经系统的血脑屏障，因此，脑脊液或血清中GFAP水平在一定程度上可反映血脑屏障功能[18]。当中枢神经系统受损后，星形胶质细胞活化增生，主要表现为GFAP快速合成，并且在血清中或脑脊液中水平增加。因此，有学者认为，星形胶质细胞激活增多可以间接反映出神经损伤的严重程度，故血清或脑脊液GFAP水平可作为评估脑部受损与否及受损程度的新型指标[19]。

本研究通过对不同日龄各亚组HIE患儿血清GFAP水平进行检测，发现不论其病情轻重，在日龄1 d时，血清GFAP水平较对照组均有所上升(P<0.01)，提示HIE患儿发病早期，血清GFAP水平即发生异常。对不同病情严重程度HIE患儿血清标本进行检测分析发现，血清GFAP水平在日龄3、7 d时随病情严重程度加重而升高，即轻度组低于中度组，中度组低于重度组，与既往的研究结果相一致[9]。另外在不同时间点对HIE各亚组血清GFAP水平进行比较，日龄3 d时血清GFAP水平最高，考虑其原因可能为此阶段大脑处于损伤极期，脑组织及神经元发生坏死、脑水肿、脑出血、脑梗死等病理改变，致使血脑屏障通透性增加，星形胶质细胞内钙超载，细胞功能稳态受破坏，细胞内环境发生改变，星形胶质细胞的坏死及活化增生刺激GFAP大量合成释放，导致血清GFAP水平升高。有临床试验表明，HIE患儿在出生后3～4 d血清GFAP水平的变化可预测其脑损伤程度及远期的运动发育状况[10]。

本研究对纳入的研究对象进行NBNA评分，结果显示HIE组不论病情轻重，在日龄3 d时NBNA评分均低于对照组(P<0.01)，且HIE各亚组间比较，日龄3、7 d时轻度组、中度组和重度组NBNA评分依次呈递减趋势(P<0.016 7)；当日龄7 d时，轻度组HIE患儿NBNA评分有所恢复，与对照组新生儿差异无统计学意义(P>0.05)，而中度组与重度组依然低于对照组(P<0.016 7)。本研究中HIE各亚组的NBNA评分在日龄3 d时NBNA评分低，提示对日龄3 d以内的HIE患儿应仔细观察其行为神经状态，并予以适当的良性刺激，改善患儿预后。

本研究分析了日龄3、7 d时HIE患儿GFAP水平与NBNA评分的相关性，结果提示血清GFAP水平越高，患儿NBNA评分越低，二者呈明显负相关(r=-0.671、-0.825，P<0.01)。研究表明，HIE患儿中枢神经系统损伤的主要原因之一为大脑缺血区域细胞死亡范围扩大导致的再灌注损伤，而再灌注损伤发生时间为30 min到72 h不等[20]。因此，在日龄3 d时，HIE患儿在此时的脑损伤程度可能最为严重，大脑处在极度缺氧缺血状态，成熟的星形胶质细胞大量合成、分泌GFAP，故此时血清GFAP水平最高，且此时神经行为功能低下，致使NBNA评分最低。在经过积极治疗后，HIE患儿的缺氧缺血状态得到改善，神经元细胞再次得到营养供给，神经系统功能得以恢复，此时的血清GFAP水平有所下降，而NBNA评分也相应上升。

综上所述，HIE患儿的血清GFAP水平与NBNA评分呈负相关，提示两个指标可共同作为HIE患儿早期诊断指标并反映其病情严重程度，可以指导治疗，对降低HIE患儿的病死率有重要意义，从而辅助改善HIE患儿的预后。但本研究只观察了日龄7 d内的HIE患儿血清GFAP水平及NBNA评分情况，时间较短，对预测HIE患儿预后价值有限，需进一步行随访研究。