芹菜叶斑病病原菌细极链格孢药剂筛选

张建强，Abdramane salah zene，王江来，李佳佳，张晓梦，吴康莉，田永强

(1.阿坝师范学院资源与环境学院，四川阿坝 624000；2.兰州交通大学生物与制药工程学院，兰州 730070；3.甘肃省植物源生物农药工程技术研究中心，兰州 730070)

0 引 言

【研究意义】芹菜(Apiumgraveolens)属伞形科芹属。近年来，甘肃地区芹菜种植因连年重茬，使得芹菜病害加重，尤其叶斑病发生严重，芹菜产量和品质受到影响。芹菜叶斑病主要危害叶片，也可危害茎。芹菜叶斑病发生高峰期在7月中旬, 此时正值高温季节, 防治难度加大。 芹菜叶斑病的防治措施很多, 除了栽培抗性品种和生物防治，目前种植过程当中主要以化学防治为主，由于引起叶斑病的病原菌不同而给田间防治带来困难，筛选出对特定病原菌有最佳效果的药剂对满足生产需求具有重要意义。【前人研究进展】引起叶斑病的致病菌种类很多，不同病原菌对不同的药剂敏感性存在差异，如引起芹菜叶斑病的病菌有芹菜尾孢菌(Cercosporaapii)[1]，链格孢(Alternariaspp.)[2]，芹菜壳针孢(Septoriaapiicola)[3]和假单胞杆菌属(Pseudomonas)[4]。目前链格孢属引起的农作物病害的防治主要以化学农药为主，如申玉香等[5]研究发现，苯醚甲环唑可有效防治芹菜叶斑病；冯连荣等[6]研究表明，10%的多抗霉素对链格孢菌(Alternariaalternata)毒力最强，EC50值为0.035 1 mg/mL；王媛媛等[7]研究表明，异菌脲对病菌的毒力作用最强，EC50值为0.36 5 mg/L，霜·锰锌、咪鲜胺锰盐等药剂对玉米链格孢病菌也具有较好的抑制效果。金程凡[8]以10%苯醚甲环唑和40%氟硅唑对芸薹链格孢(A.brassicae)进行抑制试验，其EC50分别为0.480 2和0.942 1 mg/L；徐太东等[9]以10%苯醚甲环唑、40%氟硅唑、50%福美双、70%代森锰锌对多隔链格孢菌进行防治，其EC50分别为17.89、3.41、44.27、42.34 μg/mL，用50%嘧菌酯、43%戊唑醇、40%腈菌唑对瓜链格孢进行防治，其EC50分别为3.45、21.35、5.21 μg/mL；Chang Shu等[10]用乌索酸对链格孢的防治具有非常好的效果。【本研究切入点】叶斑病对芹菜生长的危害及造成的产量损失，是目前芹菜种植过程当中主要的问题之一。细极链格孢引起的芹菜叶斑病目前尚未有报道，在甘肃部分地区芹菜叶斑病的防治一些常见的老品种杀菌剂防治效果并不理想。研究筛选对芹菜叶斑病(病菌为：细极链格孢Alternariatenuissima)具有良好防治作用的药剂。【拟解决的关键问题】采用菌丝生长速率法和琼脂片法分别用14种药剂，测定细极链格孢菌丝和孢子萌发做室内毒力，运用田间试验筛选出对细极链格孢引起的叶斑病防治效果最佳的杀菌剂，为芹菜叶斑病的科学防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试病原菌

2019年9月采集甘肃省定西市栽培地典型染病芹菜叶片，经前期分离得到致病菌为细极链格孢(A.tenuissima)[11]。

1.1.2 供试药剂

50%多菌灵、43%戊唑醇、25%嘧菌酯、25%腈菌唑、30%琥胶肥酸铜、3%甲霜恶霉灵、40%嘧霉胺、66.5%霜霉威盐酸盐、10%苯醚甲环唑、72%霜脲锰锌、22.5%啶氧菌酯、52.5%噁酮霜脲氰、30%氟环咪鲜胺；14种药剂进行室内毒力测定。表1

1.1.3 培养基

培养基选用PDA培养基(马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g)；试验主要仪器为超净工作台、灭菌锅，恒温培养箱等。

1.2 方 法

1.2.1 14种杀菌剂对芹菜叶斑病病原菌的毒力测定

采用菌丝生长速率法[12]测定14种杀菌剂对芹菜叶斑病病原菌细极链格孢的抑菌情况；将芹菜叶斑病病菌置于PDA培养基上25℃培养7 d，用直径8 mm的打孔器打取菌饼备用；将灭菌后的PDA培养基待冷却到45℃时加入相应稀释倍数的杀菌剂的量，每种药剂分别设置5个浓度梯度，制成系列不同浓度的平板待平板冷凝后，将菌饼接种于含不同稀释倍数杀菌剂的PDA培养基中央，每处理设置3个重复，以不加药剂的PDA平板为对照，25℃恒温培养箱中培养，待空白对照长满平板后，用十字交叉法[13]测量菌落直径，并计算菌丝生长抑制率，抑菌率=(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径×100%。采用生物统计方法建立病原菌菌丝生长抑制率与药剂浓度对数的毒力回归方程。以杀菌剂浓度对数为横坐标(x)，生长抑制率对应的几率值为纵坐标(y)绘制毒力回归曲线，求得毒力回归方程y=a+bx，相关系数r，并以毒力回归方程计算EC50。比较每种药剂毒力的大小，评价不同杀菌剂对芹菜叶斑病病原菌细极链格孢的抑制效果，筛选出抑制效果最好的杀菌剂[14]。

1.2.2 14种杀菌剂对细极链格孢孢子萌发的毒力测定

采用琼脂培养法[15]，并做改进，在洁净无菌的载玻片上滴加含有不同浓度杀菌剂的1.5%水琼脂培养基，待水琼脂凝成薄层后，将有琼脂培养基的一面朝上，平放在培养皿中的“U”形玻棒上，再吸取10 μL浓度为1.5×105的细极链格孢分生孢子悬浮液均匀涂抹在水琼脂平面上，平板底部加浸水的滤纸片保温培养，置于25℃温度下，培养48 h，每个处理重复3次。并以不加杀菌剂为对照。在光学显微镜下观察，每次镜检100个孢子，统计细极链格孢孢子萌发情况。萌发抑制率(%)=(对照萌发率-处理萌发率)/对照萌发率×100%[16]。求得毒力回归方程y=a+bx，相关系数r，并以毒力回归方程计算EC50。

1.2.3 田间药效试验

在定西市内官营镇芹菜种植基地进行，该种植区往年芹菜叶斑病发病较重。选择对病原菌菌丝和孢子抑制效果最好的5种药剂(3%甲霜恶霉灵、5%香芹酚、10%苯醚甲环唑、25%嘧菌酯、43%戊唑醇)进行田间试验，药剂喷施按照厂家说明书，清水作为对照。试验小区采用随机区组设计，每小区重复3次，小区面积30 m2，于发病初期(6月)喷药，共施药3次，间隔10 d。第3次施药后15 d调查发病情况，并计算发病率、防效。计算公式为：

发病率=发病株数/调查总株数×100%；

防效=(对照发病率-处理发病率)/对照发病率×100%。

1.3 数据处理

试验数据利用Excel2003和DPS 7.05数据处理系统软件进行数据分析，并应用Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 药剂对芹菜叶斑病病原菌菌丝的抑菌效果

研究表明，不同浓度梯度对芹菜叶斑病病原菌菌丝生长均有不同程度的抑制作用，浓度与抑制率呈正相关；14种供试药剂中抑菌作用最差的为25%嘧菌酯和50%多菌灵，最高浓度下抑菌率分别为9.9%和30.1%，其余12种药剂均有较好的抑制效果，其中72%霜脲锰锌抑菌效果最好，最高浓度下抑菌率为85.6%，其次为5%香芹酚，最高浓度下抑菌率为83.9%。表2

表2 不同浓度药剂下病原菌菌丝的抑制率变化

续表2 不同浓度药剂下病原菌菌丝的抑制率变化

2.2 14种药剂对芹菜叶斑病病原菌的室内毒力

研究表明，抑菌率与质量浓度对数值的相关系数达显著水平，存在线性相关。14种供试药剂对芹菜叶斑病病原菌菌丝生长抑制效果差别较大，抑制效果最好的依次为3%甲霜恶霉灵、5%香芹酚、10%苯醚甲环唑，其EC50值分别为10.8、19.9 、26.2 μg/mL；25%嘧菌酯和50%多菌灵几乎对芹菜叶斑病病原菌无抑制效果，其EC50值均大于1 mg/L。表3

表3 不同杀菌剂下芹菜病原菌菌丝的室内毒力变化

2.3 14种药剂对芹菜叶斑病病原菌孢子的抑菌效果

研究表明，不同浓度梯度对芹菜叶斑病病原菌孢子萌发均有不同程度的抑制作用，浓度与抑制率呈正相关；14种供试药剂中抑菌作用最好的为50%多菌灵和43%戊唑醇，最高浓度下抑菌率分别为98%和95.5%；抑菌作用最差的为52.5%噁酮霜脲氰和30%氟环咪鲜胺，最高浓度下抑菌率分别为40.0%和37.4%。表4

表4 不同浓度药剂下病原菌孢子的抑制率变化

续表4 不同浓度药剂下病原菌孢子的抑制率变化

2.4 14种药剂对芹菜叶斑病病原菌孢子的室内毒力

研究表明，抑菌率与药剂质量浓度对数值的相关系数达显著水平，存在线性相关。14种供试药剂对芹菜叶斑病病原菌孢子萌发抑制效果差别较大，抑制效果最好的依次为3%甲霜恶霉灵、25%嘧菌酯、43%戊唑醇，其EC50值分别为15.7、29.5、38.7 μg/mL；其中5%香芹酚、10%苯醚甲环唑、30%氟环咪鲜等也有较好的抑制效果，66.5%霜霉威盐酸盐几乎对病原菌孢子无抑制效果，其EC50值均大于1 mg/L。表5

表5 不同杀菌剂下芹菜病原菌孢子的室内毒力变化

2.5 田间防效

研究表明，5种供试药剂对芹菜叶斑病均具一定防效，但是其防治效果差异明显，其中，3%甲霜恶霉灵水剂250 g/667m2处理的防效最高，为96.3%；其次是5%香芹酚水剂100 mL/667m2处理和10%苯醚甲环唑微乳剂80 mL/667m2处理，防效分别为83.9%和78.9%，其余2个处理防效间无显著差异，防效显著低于甲霜恶霉灵处理。表6

表6 5种杀菌剂下芹菜叶斑病的防效

3 讨 论

蔬菜链格孢叶斑病病原菌多样性研究表明[17]，全国14个省份蔬菜主产区进行病害调查发现，链格孢属的8个种能够侵染包括茄科、葫芦科、十字花科和百合科的32种寄主，具有非常广泛的寄主。

近年来，芹菜在甘肃种植地区分布范围较广、规模较大、播种重茬多，再加上大棚的高温高湿环境，发病率也有所上升，导致芹菜的产量与品质受到了严重的影响。在芹菜种植中对叶斑病的防治目前主要以化学农药为主，但对细极链格孢引起的叶斑病防治未有报道，目前仅有张铮等[18]对三叶木通叶斑病病原菌细极链格孢进行过研究，药剂筛选表明戊唑醇对该病原菌菌丝生长和孢子萌发的抑制力最强。申玉香等[5]药剂筛选表明苯醚甲环唑可有效防治芹菜叶斑病，防效随着用量的增加而提高，但是未能说明引起叶斑病的具体病菌。

4 结 论

14种杀菌剂中对病原菌菌丝抑制效果最好的分别为3%甲霜恶霉灵、5%香芹酚、10%苯醚甲环唑、其EC50分别为10.8、19.9、26.2 μg/mL。对孢子萌发抑制效果最好的分别为3%甲霜恶霉灵、25%嘧菌酯、43%戊唑醇，其EC50分别为15.7、29.5、38.7 μg/mL。只有3%甲霜恶霉灵对菌丝和孢子同时具有最佳的防治效果，不仅能抑制菌丝的生长还能抑制孢子进一步对植物的扩大侵染。3%甲霜恶霉灵田间防治效果最佳，防效高达96.3%。