双孢蘑菇栽培基质中线虫分离方法评价

贾培松，贾文捷，罗 影，努尔孜亚·亚力买买提，王艺华，温切木·阿布列孜，魏 鹏

(1.新疆农业科学院植物保护研究所/农业部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室，乌鲁木齐 830091；2.哈巴河县自然资源局，新疆哈巴河 836700；3.阿勒泰市菜篮子工程办公室，新疆阿勒泰 836500)

0 引 言

【研究意义】双孢蘑菇(Agaricusbisporus)是栽培区域最广、总产量最多的一类栽培菇种[1-2]，也是新疆栽培的主要菇种之一。食用菌栽培中每年因病虫害带来产量上的损失约30%，而其中由线虫造成的损失约60%[3-5]。受线虫危害的食用菌主要有：双孢蘑菇、大肥菇、平菇、草菇、金针菇、黑木耳、毛木耳、银耳等[6-9]。其中尤以双孢蘑菇发生最普遍，危害最最重，线虫危害时，床面菌丝生长受阻，严重萎缩死亡，料面发生黑褐色，料湿，发黏，出菇少，菇形小或不出菇，并有难闻的气味，通常受害菇房的出菇期缩短，一般减少1～2潮菇，严重的生产季可缩短 1～2 个月，造成双孢蘑菇减产20～50%[10-12]。在新疆，双孢蘑菇产业是主要食用菌产业之一，每年栽培面积达60×104m2，多采用一次发酵或简单的二次发酵生产方式，线虫发生尤为普遍和严重。目前，在食用菌栽培过程中，线虫危害问题往往比较突出，研究双孢蘑菇栽培基质中线虫分离方法，双孢蘑菇线虫的有效防控有重要意义。【前人研究进展】双孢蘑菇栽培基质和覆土材料中线虫分离方法主要为贝尔曼漏斗法。利用贝尔曼漏斗法分离培养料(堆肥)和覆土的线虫，通过形态鉴定表明浙江省蘑菇生产中线虫有3科(属)5种，其中，主要为蘑菇菌丝线虫(食菌茎线虫)(DitylenchusmyceliophagusGoodey)、蘑菇堆肥线虫(AphelenchoidescomposticolaFranklin)和小杆目线虫(Rhabditata sp.)3种[13]。李发勇等[14]利用贝尔曼漏斗法分离培养料(堆肥)和覆土的线虫，通过形态鉴定初步摸清了为害浙南地区蘑菇生产的主要线虫种类为食菌茎线虫、蘑菇堆肥滑刃线虫和小杆线虫；其发生条件和侵染途径为旧菇房床架残留线虫以及后发酵温控未能达到要求的培养料。【本研究切入点】新疆双孢蘑菇生产方式多种多样，生产用栽培基质种类多样，线虫病发生情况较为复杂。不同栽培基质类型中线虫分离速率差异十分明显，并且不同的生产方式和处理方法对线虫发生数量影响很大，难以统一线虫分离方法，按照文献报道的线虫分离和统计分析方法也难以反应本地双孢蘑菇线虫实际发生情况。目前，未见对不同栽培基质中线虫分离速率和分离规律进行研究的报道。有关新疆双孢蘑菇线虫病的发生情况、发生规律等均未见报道。需确定分离双孢蘑菇栽培基质中线虫的科学方法，研究新疆双孢蘑菇线虫病的分布情况和发生规律。【拟解决的关键问题】研究不同栽培基质中线虫分离速率和分离规律，评价影响分离速率的关键因子，分析不同生产方式和栽培基质处理方法对线虫发生数量的影响，明确双孢蘑菇线虫分离的科学方法，为双孢蘑菇线虫病调查与研究提供理论基础和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材 料

分别收集感染线虫的双孢蘑菇培养料和覆土材料。采集地点为三坪农场、阜康市九运街镇、吉木萨尔县、第六师共青团农场、第六师军户农场、温泉县等6个双孢蘑菇主要种植区。表1

表1 样品采集地点及生产方式

1.2 方 法

1.2.1 病样采集

双孢蘑菇培养料，分别采集双孢蘑菇培养料发酵完成时和出菇期间的培养料；

双孢蘑菇覆土材料，分别采集覆土材料消毒完成时和出菇期的覆土材料。

采用5点随机取样法，每个样点取样200 g，混匀后为1份样品，用自封袋装好带回实验室分离检测。

1.2.2 基质材料中线虫分离

每份样品充分拌匀后，用天平称取3份，各100 g，采用贝曼漏斗法进行线虫分离，每24 h取一次线虫悬液，用灭菌蒸馏水稀释定容至10 mL，放置于划有方格线的90 mm培养皿中，于显微镜下镜检，在显微镜下观察和计数，每种实验处理设3个重复。计算线虫分离速率：

分离速率(%)=(单次分离线虫数/线虫分离总数)×100。

1.3 数据处理

应用Excel 2010软件对数据进行数据处理、单因素方差分析(AVNOA)。

2 结果与分析

2.1 不同材料类型中线虫分离速率

研究表明，不同基质材料类型中活体线虫分离速率差异十分显著，在分离24 h时，各基质材料分离速率由大到小依次为棉秆、麦草、棉籽壳和土壤材料，分离速率分别为86.05%、70.91%、37.98%和28.03%。

不同基质材料中线虫分离速率达到最高的时间不同，其中，棉秆和麦草中线虫分离速率均在24 h达到最高，分别为86.05%和70.91%，棉籽壳中线虫分离速率在48 h达到最大，为37.98%，而土壤材料中线虫分离速率在96 h达到最大，为28.03%。

不同基质材料中死体线虫分离速率趋势较一致，均是在活体线虫分离较完全时开始逐渐被分离出来，且随着时间延长分离速率呈增加趋势。不同基质材料类型中线虫分离速率差异显著，活体线虫先于死体线虫被分离出来。图1，图2

图1 不同基质材料活体线虫分离速率

图2 不同基质材料死体线虫分离速率

2.2 不同材料类型中线虫分离速率与材料孔隙度相关性

研究表明，不同基质材料孔隙度差异显著，孔隙度由大到小的材料依次为麦草、棉秆、棉籽壳和土壤材料，其孔隙度依次为3.36、2.48、2.02和1.24 mL/g；线虫分离速率与材料孔隙度相关性高，相关系数为0.799，R2=0.638 9。不同基质材料类型中活体线虫分离速率与材料孔隙度相关程度很高，并呈正相关。表2，图3

表2 不同基质材料孔隙度

图3 活体线虫分离速率与材料孔隙度的相关性

2.3 双孢蘑菇培养料不同处理方法下线虫浓度

研究表明，发酵处理完成时，不同处理方式处理的培养料中，线虫浓度差异十分显著，其中，实行工厂化二次发酵处理方式的培养料中线虫浓度最低，为0条/100g，其次为实行半工厂化二次发酵处理方式的，为2.67条/100g，实行农法二次发酵处理方式的为33.33条/100g，而实行农法一次发酵处理方式的培养料中线虫浓度最高，为1556.33条/100g；蘑菇出菇期，不同处理方式处理的培养料中线虫数量均有所增加，且差异十分明显，其线虫浓度普遍较培养料刚发酵处理后的高很多，且差异与培养料发酵处理后的趋势相似，其中，实行工厂化二次发酵处理方式的材料中线虫浓度最低，为59.21条/100g，其次为实行半工厂化二次发酵处理方式的，为112.33条/100g，实行农法二次发酵方式的，为163.33条/100g而实行农法一次发酵方式的最高，为5371.33条/100g，呈爆发式发生。双孢蘑菇培养料中线虫多少与培养料处理方式密切相关，发酵处理越彻底，线虫浓度越低。表3

表3 不同处理方式的培养料中线虫浓度变化

2.4 不同生产方式下双孢蘑菇覆土材料中线虫浓度

研究表明，各地收集的经杀虫处理后的双孢蘑菇覆土材料中线虫普遍存在，并差异显著，活体线虫浓度为每100g样品中含线虫12.00～79.00条；其中，三坪农场实行工厂化生产，覆土材料处理十分严格，线虫浓度最低，为12.00条/100g，其次第六师军户农场实行半工厂化生产，覆土材料处理也较严格，为31.67条/100g，吉木萨尔县实行农法生产方式，覆土材料处理较为粗放，线虫浓度为45条/100g，阜康市九运街镇实行实行农法生产方式，覆土材料处理最为粗放，其线虫线虫浓度最高，为79条/100g；蘑菇出菇后，各双孢蘑菇覆土材料中线虫数量普遍增加，且差异显著，活体线虫浓度为每100g样品中含线虫79.00～5 236.67条；其中，三坪农场实行工厂化生产，覆土材料中线虫浓度最低，为79.00条/100g，其次第六师军户农场实行半工厂化生产方式，为132.53条/100g，吉木萨尔县实行农法生产方式，线虫浓度为153.33，阜康市九运街镇实行实行农法生产方式，线虫浓度最高，为5 236.67条/100g。双孢蘑菇覆土材料中线虫普遍存在，出菇后覆土材料中线虫浓度普遍增加，且增加幅度与生产方式密切相关，生产方式越先进线虫密度越小。表4

表4 不同生产方式下覆土材料中线虫浓度

3 讨 论

研究结果显示，不同基质材料类型中活体线虫分离速率差异十分显著，在分离24 h时，各基质材料分离速率由大到小依次为：棉秆、麦草、棉籽壳和土壤材料，分离速率分别为86.05%、70.91%、37.98%和28.03%；不同基质材料中线虫分离速率达到最高的时间不同，其中，棉秆和麦草中线虫分离速率均在24 h达到最高，棉籽壳中线虫分离速率在48 h达到最大，而土壤材料中线虫分离速率在96 h达到最大；(3)不同基质材料孔隙度差异显著，孔隙度由大到小的材料依次为：麦草、棉秆、棉籽壳和土壤材料，且不同基质材料类型中活体线虫分离速率与材料孔隙度呈显著正相关。线虫分离速率受基质材料类型影响很大，应根据材料类型确定分离时间。

研究结果显示，培养基质中线虫浓度与生产方式和培养料处理方式密切相关，工厂化程度越高，培养料发酵处理越彻底，比如二次发酵，线虫浓度越低；双孢蘑菇覆土材料中线虫普遍存在，出菇后覆土材料中线虫浓度普遍增加，且增加幅度与生产方式密切相关，工厂化程度越高，线虫密度越小。工厂化和半工厂化生产方式下，操作比较规范，对培养料、覆土材料、生产设施设备和房的杀虫处理比较严格，出菇管理也比较科学，降低了蘑菇线虫侵染的几率，而农法生产方式下，操作比较粗放，对培养料、覆土材料、生产设施设备和菇房的杀虫处理不到位，出菇管理也较为粗放，提高了蘑菇线虫侵染的几率，处理不当，往往会引起线虫大爆发。改进双孢蘑菇生产方式，改善培养料发酵方式(尤其是采用培养料二次发酵技术)，是预防双孢蘑菇线虫发生的有效措施，

4 结 论

不同基质材料类型中的活体线虫分离速率差异十分显著，且线虫分离速率达到最高的时间不同，在分离24 h时，各基质材料分离速率由大到小依次为棉秆、麦草、棉籽壳和土壤材料，分离速率分别为86.05%、70.91%、37.98%和28.03%；不同基质材料类型中活体线虫分离速率与材料孔隙度呈显著正相关，孔隙度越大线虫分离速率越快，线虫分离速率达到最高的时间越早；培养基质中线虫浓度与生产方式和培养料处理方式密切相关，工厂化程度越高，培养料发酵处理越彻底，比如二次发酵，线虫浓度越低。线虫分离速率受基质材料类型影响很大，应根据材料类型确定分离时间；改进双孢蘑菇生产方式，改善培养料发酵方式(尤其是采用培养料二次发酵技术)，是预防双孢蘑菇线虫发生的有效措施。