外源ALA对NaCl胁迫下酸枣幼苗叶绿素合成的影响

陈丽靓，孙军利，常心怡，叶家发

(石河子大学农学院/特色果蔬栽培生理与种质资源利用兵团重点实验室，新疆石河子 832000 )

0 引 言

【研究意义】盐胁迫严重影响植物的发芽、生长，会导致作物减产[1]。新疆土壤盐碱化尤其严重，分布面积也最广，类型最多。在亚洲栽培枣属植物中，酸枣耐盐碱性好，抗旱、抗寒能力较强，根系发达，分蘖能力强[2]。枣树是新疆主要经济果树之一，酸枣又是枣树生产中常用砧木品种[3]。研究外源物质提高酸枣的耐盐性机制对新疆枣树产业发展具有重要意义。【前人研究进展】5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)不仅是叶绿素生物合成过程的第一个关键性前体物质[4]，也是植物生命活动必需的和代谢活跃的生理活性物质。Hotta等[5]研究发现，ALA是一种与植物体内叶绿素合成以及提高植物体内叶绿素含量和捕光系统稳定的生长调节类物质。近年来，研究表明ALA不仅可以提高植物的光合能力[6]和作物产量[7-8]，也能够提高黄瓜[9]、茄子[10]以及油菜[11]等作物的抗冷性，缓解盐胁迫对花生[12]、西伯利亚白刺[13]等植物的伤害。【本研究切入点】目前有关ALA在酸枣的叶绿素上的影响研究比较少。而酸枣的一些重要价值逐渐被发现[14]。需研究新型植物生长调节剂ALA与盐胁迫结合，分析盐胁迫下酸枣幼苗的叶绿素合成通路上关键中间产物。【拟解决的关键问题】以酸枣水培幼苗为材料，测定叶绿素前体物质含量、叶绿素含量，研究盐胁迫下外源ALA对酸枣幼苗叶绿素合成的影响，为研究外源ALA提高酸枣的耐盐性机制提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

所用酸枣种子购自陕西省榆林市佳县，ALA购自美国Sigma公司。试验地点位于石河子大学农学院特色果蔬栽培生理实验室与种质资源利用兵团重点实验室。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

将大小一致且完好无损的酸枣种子在室温(20℃)下浸种24 h，用0.5% KMnO4杀菌消毒30 min后，摆放在垫有湿润滤纸的发芽盒内。用蒸馏水保持种子湿润，发芽前先全天黑暗，等到发芽后保持光照强度为12 000 lx，14 h光照，温度控制在26℃左右，相对湿度65%～70%。待幼苗长至2片真叶时，选择大小一致，长势整齐的酸枣幼苗，移栽定植到装有1/2倍500 mL日本园试营养液的水培盒(19×13×11) cm中，培养一周后换成1倍的日本园试营养液，置于人工气候箱(RXZ智能型，宁波江南仪器厂)内培养。待幼苗长至6片真叶时，进行试验处理。

共设置4个处理：(1)对照(CK)：叶面喷施蒸馏水；(2)ALA处理：叶面喷施100 mg/L ALA；(3)NaCl处理：营养液中添加150 mmol/L NaCl，叶面喷施蒸馏水；(4)NaCl+ALA处理：营养液中添加150 mmol/L NaCl，喷施叶面喷施100 mg/L。每个处理重复3次，每盒15株幼苗。为避免盐激反应，NaCl处理和NaCl+ALA处理中，NaCl浓度按每天50 mmol/L的浓度梯度递增，于同一天达到目标浓度，此时为NaCl处理0 d。处理3 d后取样。

1.2.2 测定指标

1.2.2.1 叶绿素合成各前体含量

ALA测定参考Wu[15]的方法。选取酸枣叶片0.5 g，用三氯乙酸(质量体积比为4%)提取，将提取液、1 mol/L NaAc、乙酰丙酮以及1 mol/L醋酸盐缓冲液(pH4.6)混合，含量分别为5、2.35、0.15、2.5 mL，水浴加热10 min，冷却至室温后进行显色，测其波长为553 nm处的吸光值A，根据标准曲线计算ALA的含量。显色选取的试剂为Ehrlich-Hg试剂，其制配过程为：在30 mL的乙酸中加入P-二甲氨基苯甲醛1 g，将其溶解，加入8 mL 70%高氯酸，使用乙酸溶液稀释至50 mL，再添加HgCl220.2 g。溶液可以保存在棕色瓶当中，瓶身采用锡纸包覆，可在4℃冰箱里面长期保存。

单卟啉胆色素原(PBG)含量的测定参照牛奎举[16]的方法，并且加以改进。选取酸枣叶片0.5 g，使用液氮进行研磨，再用5 mL提取缓冲液(0.6 mol/L三羟甲基氨基甲+0.1 mol/L乙二胺四乙酸)进行提取，104×g离心10 min，选取上清液、Ehrlich-Hg试剂各2 mL混合均匀，在黑暗环境中显色，为15 min，测其吸光值A，波长为553 nm。

原卟啉Ⅸ、Mg-原卟啉Ⅸ以及原叶绿素酸酯的含量测定参照Hoduins等[17]方法。选取新鲜酸枣幼苗的叶片0.3 g，加入25 mL的提取液进行研磨，提取液为80%的碱性丙酮溶液，溶液由体积比为4:1的丙酮溶液和1%氨水溶液制配而成，提取完成后，分别测定575、590、628 nm波长下的吸光值。

1.2.2.2 叶绿素含量

叶绿素的提取参考沈伟其[18]方法，并加以改正，分别称取0.2 g剪碎的不同处理的新鲜的酸枣幼苗的叶片，混匀，置于15 mL的刻度试管中，再加入10 mL乙醇∶丙酮=1∶1的混合提取液中，用保鲜膜封口，用锡纸包裹，放置在黑暗条件下浸提24 h左右，至果皮颜色变白，提取上清液，分别在663、645、440 nm波长下测吸光值，每个处理重复3次，取平均值。

1.3 数据处理

使用IBM SPSS Statistics 24进行数据分析，Microsoft Excel 2010绘制表格以及作图。

2 结果与分析

2.1 不同处理对酸枣幼苗叶绿素各前体含量的影响

2.1.1 不同处理对酸枣幼苗内源ALA含量影响

研究表明，与CK相比，外源单独喷施ALA处理和NaCl处理下酸枣幼苗的内源ALA含量分别提高了50.7%、33.9%；NaCl+ALA处理下酸枣幼苗内源ALA含量较NaCl处理显著提高44.8%。图1

注：图中标注不同小写字母表示处理后各处理间差异显著性(P<0.05)。下同

2.1.2 不同处理对酸枣幼苗胆色素原含量影响

研究表明，外源单独喷施ALA处理和NaCl处理下酸枣幼苗胆色素原含量较CK处理分别提高了35.9%、16.9%；与NaCl处理相比，NaCl+ALA处理下酸枣幼苗胆色素原含量显著提高20.8%。图2

图2 不同处理下酸枣幼苗胆色素原含量变化

2.1.3 不同处理对酸枣幼苗原卟啉Ⅸ含量影响

研究表明，与CK相比，单独喷施ALA处理下酸枣幼苗原卟啉Ⅸ含量显著提高20.0%；NaCl处理下酸枣幼苗的原卟啉Ⅸ含量降低了12.1%。NaCl+ALA处理下酸枣幼苗原卟啉Ⅸ含量较NaCl处理显著提高21.2%。图3

图3 不同处理下酸枣幼苗原卟啉Ⅸ含量变化

2.1.4 不同处理对酸枣幼苗Mg-原卟啉Ⅸ含量的影响

研究表明，外源单独喷施ALA处理下酸枣幼苗的Mg-原卟啉Ⅸ含量较CK处理显著提高27.0%；与CK相比，NaCl处理下酸枣幼苗的Mg-原卟啉Ⅸ含量降低了19.5%。NaCl+ALA处理下酸枣幼苗Mg-原卟啉Ⅸ含量较NaCl处理提高了26.4%。图4

2.1.5 不同处理对酸枣幼苗原叶绿酸酯含量的影响

研究表明，与CK相比，外源单独喷施ALA处理下，酸枣幼苗原叶绿素酸酯含量显著提高42.7%；NaCl处理下酸枣幼苗的原叶绿素酸酯含量较CK处理降低了28.8%。NaCl+ALA处理下酸枣幼苗原叶绿素酸酯含量较NaCl处理提高了36.5%。图5

2.2 不同处理对酸枣幼苗叶绿素含量的影响

研究表明，与CK处理相比，外源单独喷施ALA对酸枣幼苗叶绿素含量没有显著性变化；NaCl处理下酸枣幼苗的叶绿素a、b含量以及总含量较CK处理分别降低了23.5%、22.3%、19.8%；NaCl+ALA处理下酸枣幼苗叶绿素a、b含量以及总含量较NaCl处理分别显著提高36.0%、38.4%、41.2%。图6

图6 不同处理下酸枣幼苗叶绿素含量变化

3 讨 论

在高等植物中，光合作用在植物生长、产量以及抗逆性方面具有十分重要的作用[19]，而叶绿素是参与光合作用中光能吸收、传递和转化的重要色素，是参与植物光合作用的重要物质[17]。植物光合速率以及有机物质的积累与叶绿素含量的高低密切相关，常作为衡量叶片功能强弱的一个重要指标[20]。ALA是高等动植物体中都普遍存在的一种非常重要的生长调节类物质[21]，在植物体内可以促进叶绿素的合成[5]，提高光合作用和保护酶活性，从而抑制膜质过氧化[22-23]。

ALA可以显著提高葡萄果皮[24]、萝卜[25]叶片叶绿素含量；李丹丹等[26]提出低浓度的ALA可以显著提高紫花苜蓿农牧806幼苗叶片中叶绿素含量，而随着ALA浓度的增加，叶片光合色素含量显著降低。研究表明，外施100 mg/L ALA处理下酸枣幼苗的叶绿素含量较CK处理无显著性变化，而其他前体物质较CK处理显著增加，与前人结果不一致，实验中外施100 mg/L ALA对酸枣幼苗的叶绿素含量不起作用的原因可能是ALA浓度太高，外源ALA对酸枣幼苗叶绿素含量的作用存在浓度效应。

在高等植物叶绿素的生物合成途径中 (Glu→ALA→PBG→ Uro Ⅲ→ Proto Ⅸ→ Mg-proto Ⅸ→ Pch l→ Chl a→ Chl b) ，任何一步受到影响，叶绿素含量就会受到影响[27]。NaCl胁迫下，菠菜叶片的叶绿素含量下降，胆色素原和内源ALA积累，盐胁迫可能使PBG向UroIII转换的过程受阻[28]；实验研究与前人结果一致，150 mmol/L NaCl胁迫下酸枣幼苗内源ALA含量、胆色素原含量显著增加，叶绿素含量显著降低，盐胁迫下，酸枣幼苗的ChI a和ChI b均降低，其上游物质Proto IX、Mg-Proto IX、PchI含量也同时降低。

外源喷施ALA可以显著提高盐胁迫下黄连种子[29]、夏枯草[30]、颠茄[31]、番茄[32-33]的叶绿素含量和内源ALA含量；燕飞等[34]发现，盐胁迫下，外施外源ALA可以显著增加黄瓜幼苗的胆色素原含量(PBG)、原卟啉Ⅸ含量、Mg-原卟啉Ⅸ含量、叶绿酸酯含量以及叶绿素含量。本实验研究表明，NaCl+ALA处理下酸枣幼苗的前体物质含量、叶绿素含量较NaCl处理显著性提高，与前人研究结果一致。在NaCl胁迫下对酸枣幼苗喷施外源ALA后，抑制其叶片中叶绿素的分解速度，可能是由于外源ALA可以通过促进PBG和UroⅢ等中间产物向下游转化，促进叶绿素合成[33]，有效缓解了NaCl胁迫对酸枣幼苗的叶绿素代谢的影响。

4 结 论

与150 mmol/L NaCl处理相比，外施100 mg/L ALA显著提高了酸枣幼苗的内源ALA含量、胆色素原含量、原卟啉Ⅸ含量、Mg-原卟啉Ⅸ含量、原叶绿酸酯含量、叶绿素a、b含量以及叶绿素总含量，较NaCl处理分别提高44.8%、20.8%、21.2%、26.4%、36.5%、36.0%、38.4%、41.2%；且叶绿素合成受阻位点在ALA向PBG转化的过程。外源喷施100 mg/L 外源ALA可以提高NaCl胁迫下酸枣幼苗的光合能力，促进幼苗生长。