不同轮套作模式对植烟土壤根际微生物群落的影响

王 灿，肖志鹏，向鹏华

（湖南省烟草公司衡阳市公司，湖南 衡阳 421000）

根际微生物是指在植物根系直接影响的土壤范围内生长繁殖的微生物，主要包括细菌、放线菌、真菌、藻类和原生动物等，其数量一般是根际外的几倍至几十倍，与植物根系相互作用[1]。微生物可以将有机物分解为无机物，为植物提供有效养料，还能分泌维生素、生长刺激素等促进植物生长，而根系分泌物和脱落物是微生物主要的营养来源和能量来源，根际的通气条件和水分状况可形成有利于微生物的生态环境[2]。

烟草属忌连作的作物，根际微生物区系失衡是连作障碍发生的重要原因，会影响烤烟根际微生物群落的稳定性，对烟株根系造成消极影响，从而对烤烟的产量和品质产生不利影响[3]。肖苗苗等[4]研究了小麦玉米轮作对根际微生物多样性的影响，结果表明玉米季的微生物丰富度高于小麦季，这说明轮作对于植株根际微生物物种组成和多样性具有显著影响。张子龙等[5]发现，轮作增加了土壤放线菌数量，略微降低了细菌数量，对真菌数量影响不大，但增加了微生物的丰富度和多样性指数。李喆等[6]研究了不同种植模式对烟田微生物群落生态特征的影响，结果表明，相比于连作，轮作对保持烤烟根际微生物的高活性起到积极作用。根际微生物对烟草育苗、生长、病害防治和土壤改良等方面有显著影响[7]，合理轮作/间作可以调节不同作物对营养元素的需求，改善烟草生长环境，有利于烟草生长。然而，目前关于烟草种植模式特别是中药材—烟草轮作模式的根际微生物研究较为缺乏。因此，笔者采集了不同作物与烟草轮套作后的土壤样品，通过分子生物学方法分析根际土壤中的微生物信息，探究不同轮作模式下烟草根际微生物群落组成和多样性的差异，为开拓烟草栽培新模式提供理论依据和实践基础。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验采集了6种作物与烟草轮套作后的土壤，分别为半夏（BG）、香菜（XG）、大蒜（DG）、蒲公英（PG）、射干（SG）、豌豆（WG），以烟草连作土壤作对照（CK）。每个小区面积130 m2，采用随机区组排列，重复3次。烟草上部叶收获时按照取样要求采取根际土壤，共收集21个根际土壤样本，置于冰袋中立即运至实验室于4℃以下保存，并在一周内完成样品预处理。

1.2 分子生物学检测

使 用E.Z.N.A.® stool DNA Kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，USA）试剂盒提取每个样品的DNA，所有DNA样本在使用前均保存在-20℃冰箱中。采用实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）测定细菌16S rRNA基因和真菌内部转录间隔（ITS）基因的丰度。每个qPCR混合物包含10 μL Premix Ex Taq™（2×）（Vazyme生物科技有限公司，南京），正向引物和反向引物各0.8 μL（5 μmol/L），1 μL模板DNA，注入灭菌去离子水至最终体积为20 μL。16S rDNA的引物序列为338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）；ITS基因的引物序列为ITS 1F （5'- CTTGGTCATTTAGGAAG TAA-3'）和ITS 2R（5'-GCTGCGTTCTTTTCATCGATG C-3'）。

PCR 扩增步骤参考李强等[8]的报道。扩增结束后，回收PCR扩增产物。从2%琼脂糖凝胶中提取扩增子，并使用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒纯化（Axygen Biosciences， Union City，CA， USA），然后使用QuantiFluor™-ST （Promega， USA）进行定量分析。纯化的扩增产物按等分子量汇集，然后在Illumina MiSeq （Allwegene，Beijing）平台上按照标准方案进行配对端测序。

1.3 生物信息学分析

使用PRINSEQ和 Moetur对原始测序数据过滤，修剪。以序列相似度不低于97%为原则，利用Qiime中的 Uclust工具对有效序列进行聚类分析，根据FAPROTAX数据库的物种注释分类出具有生物学意义的操作分类单元OTUs（Operational taxonomi units）。利用Qiime软件，计算每组样品的Alpha多样性指数。使用R-studio软件分别绘出真菌和细菌纲水平上的群落结构，以便进一步分析不同处理烟草根际土壤黑胫病与青枯病致病菌的基因拷贝数。采用Canoco 5.0 软件进行主成分分析（PCA）。

2 结果与分析

2.1 不同处理烟草根际土壤微生物多样性的比较

如图1所示，相对于CK处理，除了大蒜（DG）处理显著降低了细菌多样性外，其他轮作模式均显著增加了细菌多样性（P＜0.05）；而对于真菌，只有香菜（XG）和射干（SG）处理显著增加了真菌多样性（P＜0.05），其他轮作处理对真菌多样性无显著影响。

图1 不同处理烟草根际土壤的细菌（A）和真菌（B）多样性

2.2 不同处理烟草根际土壤的微生物群落多样性

聚类分析和主坐标分析（图2）结果表明，同一处理的点位均聚集在一起，表明处理间重复性较好；而不同处理间明显分散聚团，表明不同处理间微生物群落结构差异较大，即不同作物与烤烟轮作对烟草根际土壤细菌和真菌的群落结构组成的影响较大。其中，蒲公英（PG）和香菜（XG）处理的细菌群落结构更相似；而对于真菌，半夏（BG）、大蒜（DG）和蒲公英（PG）处理与CK聚集在一起，表明它们的根际土壤具有相似的真菌群落组成，而香菜（XG）、豌豆（WG）和射干（XG）处理的真菌群落结构与其他4组有显著差异（P＜0.05）。

图2 不同处理烟草根际土壤的细菌（A）和真菌（B）群落结构

2.3 不同处理烟草根际土壤的真菌群落结构

图3为不同处理在纲水平上的真菌群落组成，其中香菜（XG）处理的真菌群落组成与其他组差异最大。在纲分类水平上，子囊菌门的粪壳菌纲（Sordariomycetes）为对照组根际土壤的优势菌种，平均相对丰度超过50%，其次为子囊菌门的座囊菌纲（Dothideomycetes），平均相对丰度约为20%；但香菜（XG）、豌豆（WG）和射干（SG）处理均显著降低了粪壳菌纲的相对丰度（P＜0.05），而且香菜处理增加了座囊菌纲（Dothideomycetes）、伞菌纲（Agaricomycetes）以及其他丰度相对较低或分类地位未知类群的丰度，豌豆处理（WG）的被孢霉纲（Mortierellomycetes）的丰度显著高于其他组。

图3 不同处理烟草根际土壤真菌在纲水平上的群落组成

2.4 不同处理烟草根际土壤的细菌群落结构

图4为不同处理在纲水平上的细菌群落组成。相对于真菌群落组成，香菜（XG）处理对细菌群落组成的影响相对较小。与CK相比，香菜（XG）和蒲公英（PG）处理显著降低了α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）和放线菌纲（Actinobacteria）的相对丰度，增加了拟杆菌纲（Bacteroidia）、Subgroup 6和Blastocatellia（Subgroup 4）的相对丰度；相反，大蒜（DG）处理则显著降低了拟杆菌纲（Bacteroidia）的相对丰度，同时增加了放线菌纲（Actinobacteria）的相对丰度。

图4 不同处理烟草根际土壤细菌在纲水平上群落组成变化

2.5 不同轮套作模式对植烟土壤致病微生物群落的影响

利用荧光定量PCR分析了不同模式下烟草土壤青枯菌和黑颈病致病菌丰度变化，结果如图5所示。所有处理均显著降低了青枯病致病菌数量，但不同轮套作模式的作用效果不同，其中豌豆轮套作和香菜轮套作的效果较好，半夏套作的效果最差。而对于黑胫病致病菌，只有蒲公英、豌豆和香菜显著降低了其致病菌数量，其他处理对黑胫病抑制效果不显著，半夏处理反而显著增加了黑胫病致病菌数量。综合比较，豌豆轮套作和香菜轮套作对抑制黑胫病和青枯病均有较好的效果。

图5 不同处理烟草根际土壤黑胫病与青枯病致病菌的基因拷贝数

3 结论与讨论

根际土壤微生物的数量和种类是影响植物生长发育和健康状况的重要因素[8-9]，不同的根际微生物群落负责不同的生态系统功能[10]，根际微生物的变化直接影响土壤养分的吸收转化[11]，有益微生物可提高土壤有效养分含量并促进植物吸收[12]，在促进植物生长的同时提高植物抗病能力和抗逆能力[13]。相关研究表明，不同的耕作制度会影响根际土壤微生物的多样性及组成[14-15]，特别是有益微生物的多样性及组成。

研究发现，相较于CK处理，大部分轮套作处理的根际细菌多样性以及部分轮套作处理的真菌多样性显著提高，且不同轮套作处理的细菌和真菌群落结构均呈现较大差异。这说明不同轮套作处理在提高根际微生物多样性的同时，还显著改变了根际土壤的微生物群落结构组成，对微生物种类、数量、丰富度等均有一定影响。具体比较了不同轮套作处理烟草根际微生物在纲水平上的真菌及细菌群落组成，可以发现香菜、蒲公英处理对真菌和细菌群落组成影响最大，这表明烟草根际微生物对香菜、蒲公英更为敏感。试验结果显示，烟草根际微生物中子囊菌门的粪壳菌纲（Sordariomycetes）、子囊菌门的座囊菌纲（Dothideomycetes）为优势真菌纲，α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）和拟杆菌纲（Bacteroidia）为优势细菌纲。这些有益菌参与土壤养分循环，并且与土壤碳、氮等关键养分含量呈正相关，进而促进烟草生长发育并提高烟叶品质。除此之外，试验还发现轮套作处理显著降低了青枯病和黑胫病的致病菌数量，表明试验所选几种作物与烟草轮套作对黑胫病和青枯病有较好的抑制效果，值得进一步深入研究。

总体来看，试验所选几种作物与烟草轮套作对其根际土壤微生物菌群结构和丰富度有显著影响，各处理都在不同程度上提高了土壤微生物的多样性，但在群落结构的组成上各不相同；不同轮作处理均显著改变了土壤细菌和真菌的群落结构组成，香菜处理的真菌群落组成与其他组差异最大；其中豌豆轮作和香菜套种对黑胫病和青枯病具有较好的抑制效果。