青藏高原喜马拉雅旱獭布鲁氏菌病血清流行病学调查分析

杨旭欣，徐立青，李积权，于守鸿，谢 辉，薛红梅，张爱萍，任玲玲，樊 迪，马 丽

布鲁氏菌病(简称布病)是由布鲁氏菌属(简称布氏菌)的细菌侵入机体，引起的人兽共患的传染—变态反应性疾病，是《中华人民共和国传染病防治法》规定报告的乙类传染病[1-2]。

青海省位于青藏高原东北部，平均海拔3 500 m，面积71.15 km2，牧区面积10.51亿亩，是我国的四大牧区之一，是历史上人畜布病的高发区。草原上野生动物种类繁多，其中喜马拉雅旱獭是青藏高原特有的、常见的野生啮齿动物，分布广、数量多，栖息地与家畜共同生活在同一自然环境内，促使喜马拉雅旱獭与人、畜关系密不可分，致使其易感染多种传染病，而对其感染布病的研究从未中断，1981年在玉树州玉树县检测274匹旱獭，血清学检测均为阴性，1982年在海北州海晏县检测喜马拉雅旱獭340匹，阳性率3.25%，1986年在果洛州达日县检测喜马拉雅旱獭1 117匹，阳性率1.88%。1994年在海西州天峻县检测80份旱獭血清样品，阳性率2.5%[3-5],从1963-1994年共计采集2 106份旱獭血样，虎红平板凝集试验阳性35份，试管凝集试验阳性19份。2016年我们在喜马拉雅旱獭血样品中分离出1株疑似布氏菌株，经过形态、染色、生化、噬菌体裂解试验初步鉴定为布氏菌属，并通过分子生物学技术进一步证实该菌为布氏菌[6-7]。

1 材料与方法

1.1 材料 选取青海省人、畜有布病流行地区，选取乌兰县、天峻县、玛沁县、玛多县、玉树县、同德县等27个县(市)，每个县按旱獭栖息地(青藏高原高山草原、高寒草甸、灌丛草甸和高寒草原)选5个点，每个点8～11匹进行现场样本采集。共计1 466匹旱獭。

1.2 实验试剂 布鲁氏菌虎红凝集抗原、试管凝集抗原、兽用阴/阳性标准血清均由中国兽医药品监察所提供，均在有效期内，羊布鲁氏杆菌病抗体快速检测试剂盒由广州悦洋生物科技有限公司提供。

1.3 试验方法 取旱獭心脏全血，首先进行鼠疫耶尔森菌血清学检测(均为阴性)；随后进行虎红平板凝集试验(RBPT)、胶体金免疫层析技术(GICA)、试管凝集试验(SAT)。

1.3.1 判定标准 以《动物布鲁氏菌病诊断技术(GB/T18646-2002)》为标准进行RBPT、GICA初筛，然后以SAT为金标准法比对。

1.3.2 胶体金免疫层析技术 按照产品说明书的规定，取待检血清10 μL滴入试纸条的样品孔中，然后再垂直滴入缓冲液4滴，20 min内判定结果，判定时间是在室温15～30 ℃下进行，结果判定：在结果视窗中出现两条紫色线(C为质控线，T为检测线)则为阳性，若结果视窗中仅出现一条紫色线则为阴性，未出现对照紫色线(C)说明结果无效。

1.3.3 试管凝集试验 由于血样采自旱獭心脏血样总量较少，在检测布病前还需进行鼠疫耶尔森菌F1抗体检测，结果为阴性后才能进行布病血清学检测，致使只有少量血样可以进行试管凝集试验，因此采用了微量试管凝集试验。

1.4 统计学方法 运用SPSS 19.0统计软件进行统计分析。Kappa一致性检验强度判断标准：Kappa值<0为极差，0～0.2为微弱，0.21～0.40为弱，0.41～0.60为中度，0.61～0.80为高度，0.81～1为最强。

2 结 果

2.1 血清样本检测结果 对1 466份旱獭血样品进行RBPT、GICA和SAT检测。结果显示，RBPT检出阳性样品64 份，检出率 4.37%(64/1 466)；GICA检测出抗体阳性样品28份，检出率1.91%(28/1 466)；SAT检出阳性18例，检出率1.23%(18/1 466)，详见表1。其中胶体金试纸条检测出的28份阳性样品同时为虎红平板凝集试验阳性样品。

表1 3种检测方法检出数及阳性率

2.2 RBPT与SAT进行对比 RBPT与SAT检出率差异有统计学意义(χ2=399.214，P<0.001)，检测结果灵敏度为100%，特异度为96.82%，Kappa值为0.43，两种方法的一致性强度为中度(Kappa值0.41～0.60)，说明一致性一般(表2)。

表2 RBPT与SAT布鲁氏菌检测结果符合率对比

2.3 GICA与SAT进行对比 GICA与SAT检出率差异有统计学意义(χ2=935.920，P<0.001)，检测结果灵敏度为100%，特异度为99.31%，Kappa值为0.709，两种方法的一致性强度为高度(Kappa值0.61～0.80)，说明一致性好(表3)。

表3 GICA与SAT布鲁氏菌检测结果符合率对比

2.4 地区分布

2.4.1 RBPT阳性地区 64份RBPT阳性结果分布在青海省的6州中的14个县(市)，见图1。

图1 虎红凝集试验检测阳性分布地区

2.4.2 GICA阳性地区 28份GICA阳性结果同样分布在青海省的6州中的14个县(市)，见图2。

图2 胶体金免疫层析试验阳性分布地区

2.4.3 SAT阳性地区 18份SAT阳性结果[1∶50(++)以上]分布在青海省4州中的7个县(市)，见图3。

图3 试管凝集试验阳性地区

3 讨 论

目前布病免疫学检测方法主要采用RBPT和SAT，这2种方法都有其优缺点。RBPT特异性和敏感性较高、成本低廉，但易出现假阳性[8-9];SAT是常规血清学方法，但存在抗原和血清用量大、操作步骤复杂、出结果慢等缺点，两者同时检测时工作量大、费时、费力，并且须专业人员检测，而GICA血清用量上非常少、对血液的要求不高，操作简便、快速，可就地进行筛查[10-11]。非专业人员也可以用胶体金法进行检测，并且不会造成由不同操作者主观判读而致结果差异等现象。但是GICA所使用的抗原和RBPT有所不同，GICA使用的是基因重组抗原，RBPT使用的是不同的菌体抗原，会影响抗原抗体特异性反应，造成结果差异[12]，因此，不能单独使用GICA检测，这就需要采用SAT金标准法进行确证试验。

对1 466份旱獭血样检测结果表明，RBPT单阳性数为36份，分析原因是由于喜马拉雅旱獭全血样本采集一般在野外进行，运输过程中有车辆颠簸摇晃的情况，全血样本容易出现溶血现象导致血清中含有红血球，进行RBPT时出现了假阳性现象；为了验证RBPT阳性结果，采用了敏感度和特异度高、检测样本不受限制的GICA检测方法进行复检，RBPT、GICA双阳数为28份，最后采用微量SAT法进行确证试验，RBPT、GICA、SAT三阳数为18份，阳性率1.23%，由于《动物布鲁氏菌病诊断技术(GB/T18646-2002)》中没有关于喜马拉雅旱獭SAT试验凝集反应程度的判读标准，就以猪、山羊、绵羊、狗SAT结果[1∶50(++)以上]为依据判定出阳性18份，同时从18份样本中分离到5株布鲁氏菌，由此可以推断在喜马拉雅旱獭中有布病疫情的发生。然后根据布病免疫学检测方法检出的抗体阳性样本来源，绘制出了RBPT、GICA、SAT抗体阳性地区分布图，为今后确定青海喜马拉雅旱獭布病地理分布提供依据，同时，为制定多样化防控技术和控制青海省布病疫情提供至关重要的技术支持。

利益冲突：无

引用本文格式：杨旭欣，徐立青，李积权，等.青藏高原喜马拉雅旱獭布鲁氏菌病血清流行病学调查分析[J].中国人兽共患病学报，2022，38(1)：79-83.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.175