衣原体纳米疫苗的研究进展

谢丽娟，谢小平，孙珍洁，陆春雪

在纳米科技发展过程中，纳米材料是处于最前列的一个分支。纳米粒子可负载核酸(DNA和mRNA)或蛋白质亚单位，并能靶向表达或直接递送抗原[1]。纳米粒子(Nanoparticles，NP)作为佐剂或抗原递送系统不仅能有效增强免疫原诱导的体液及细胞免疫应答，还能抑制抗原降解、增强抗原和佐剂共递送、维持抗原在黏膜部位释放[2-3]，从而有效激发机体的黏膜免疫应答。衣原体是严格真核细胞内寄生的特殊细菌，种类繁多，从黏膜局部入侵是衣原体感染机体的重要途经，如沙眼衣原体引起的结膜炎、泌尿生殖道感染和肺炎嗜衣原体引起的呼吸道感染等。因此，有效激发黏膜免疫应答是衣原体疫苗研发的重点，纳米粒子与常规衣原体疫苗的结合，是衣原体疫苗研发的重要方向。目前，应用于衣原体纳米疫苗研究的纳米粒子主要有脂质体和多聚体微粒。

脂质体(Liposomes)属于人工膜类别,按所带电荷不同分为中性脂质体、阴离子脂质体、阳离子脂质体。阳离子脂质体因具有免疫刺激作用而被用作疫苗佐剂，常用于衣原体疫苗的该类佐剂有DDA-MPL和阳离子佐剂配方(Cationic adjuvant formulation, CAF)如CAF01、CAF04以及CAF09。脂质体表面电荷对其佐剂作用有着重要影响[4]。脂质体表面电荷可显著影响其内化，其中阳离子脂质体的内化更为明显，并且其内化作用大小随脂质体直径变化而变化[5]。

多聚体(Multimer)微粒由可降解的多聚物构成，抗原通过被包覆在微粒中而进行递送，这使多聚体具有发展为单次剂量疫苗的潜力[6]。壳聚糖(Chitosan)是一种天然阳离子多糖聚合物，其衍生物糖化壳聚糖、硫醇化壳聚糖和三甲基壳聚糖(N,N,N-trimethyl chitosan , TMC)等被广泛用于药物递送、疫苗递送及食品应用等方面的研发[7]；六聚体是基于非层状液晶相的纳米颗粒，具有特殊超分子结构，可捕获和运输多种活性药物成分，因此该颗粒作为药物递送系统越来越受关注, 但作为亚单位疫苗佐剂的应用潜力尚未被深入挖掘[8]；聚DL-乳酸-羟基乙酸(Poly D, L-lactide-co-glycolic acid，PLGA)是一种无毒有机化合物，具有良好的生物相容性及成囊和成膜特性，被用于制药工程、医用工程以及现代化工业；纳米胶囊(Nanocapsules)作为载药系统，能保护所载药物免受外环境影响、控制药物的体内释放，同时尺寸效应使其具有优良的表面效应，从而具有更好的材料亲和性、生物相容性、受体聚积性、靶向性，在生物体内也更易被吸收利用等。

自纳米科学与技术应用于医学领域以来，形成的纳米医学强力推动了医学各学科的发展，为衣原体疫苗研究提供了丰富的新思路。

1 脂质体

脂质体是一类微型囊泡体，能将药物包封于类脂质双分子层内部，凭借其与细胞膜融合的特点而使药物进入胞内。除可降低药物毒性作用以外，脂质体还具有靶向性、淋巴定向性、缓释和提高药物稳定性等作用。脂质体常被用作临床药物载体，并有望制成基因药物载体。近年来，学者们逐渐将脂质体引入疫苗研究领域，但其作为疫苗载体通常遇到包装限制的问题[8-10]。许多体内研究结果表明，阳离子脂质体载体优于阴离子和中性脂质体，其中阳离子脂质体通过将抗原靶向输送至抗原呈递细胞(Antigen-Presenting Cell，APC)，在疫苗递送系统中发挥重要作用[11]。几种常见衣原体疫苗阳离子脂质体佐剂及特点见表1。

表1 阳离子脂质体佐剂的特点

1.1 CAF01 阳离子佐剂配方1(CAF01)是由双十八烷基二甲基溴化铵(dimo-thylidioctyl ammonium bromide，DDA)和海藻糖-6,6′-二苯甲酸酯(trehalose-6,6′-dibehenate，TDB)组成的脂质体[12]。DDA是一种表面活性剂，具有固定的亲水和疏水基团，亲水基团由含两个甲基的阳离子季铵基组成，疏水基团由2条含饱和碳-18的烷基链组成；DDA的佐剂作用体现于其结合抗原和APC细胞膜的能力，从而使APC对抗原的摄取和呈递增加[13]。免疫增强剂TDB是分枝杆菌索状因子海藻糖-6,6′-二苯乙酸酯(trehalose 6,6-dimycolate, TDM)的合成类似物[14]，构成TDB海藻糖头部基团的2个吡喃葡萄糖环分别通过酯键连接至2条含饱和碳-22的酰基链[12]。TDB较TDM在体内的毒性小，同时具有佐剂作用[15]。有报道称，C型凝集素是TDB的重要受体，参与Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)依赖的syk-CARD9/Bcl10/Malt-1信号途径[16-17]。TDB是一种强大的免疫增强剂，与仅含DDA成分的脂质体相比，由DDA和TDB组成的脂质体(CAF01)可诱导更强的免疫应答[18]。

CAF01脂质体佐剂，既可促进机体产生中和抗体，同时对CD4+T细胞应答也有重要的协同作用，被广泛应用于衣原体疫苗研究[19]。衣原体种类繁多，可引起人类和动物多种疾病，其中沙眼衣原体导致的泌尿生殖道感染已超过淋球菌，成为细菌性性传播疾病的首位病因，然而临床尚无衣原体疫苗可用。2019年，Abraham等[20]首次报道衣原体的临床实验，该实验以衣原体重组蛋白CTH522为抗原，以CAF01脂质体或氢氧化铝为佐剂，参与者被随机分为3个组：CTH522+CAF01脂质体接种组、CTH522+氢氧化铝接种组，安慰剂(生理盐水)接种组。结果显示，CTH522抗原辅以CAF01脂质体佐剂或氢氧化铝佐剂，经3次肌肉接种和2次鼻内加强免疫后，均表现出安全且良好的耐受性，其中CAF01脂质体接种诱导产生的血清特异性抗体滴度更高，且检测到黏膜局部有sIgA升高。尽管，该临床试验没有检测机体的细胞免疫应答水平，但为进一步应用CAF01脂质体于衣原体疫苗研究，提供了广阔的前景。

1.2 CAF04 将阳离子脂质体与免疫增强分子相结合是设计新型疫苗佐剂的有效途径。Martin-Bertelsen等[21]利用分枝杆菌脂质单霉酰基甘油(monomycoloyl glycerol, MMG)，合成了一种结构类似物MMG-1，并将阳离子表面活性剂DDA与MMG-1结合，制备了阳离子佐剂配方4(CAF04)，热分析及低温透射电镜观察均证实MMG-1能自动进入DDA脂质双层中，并能稳定存在至少6个月。为评估免疫增强分子MMG-1的加入能否影响脂质体DDA的佐剂活性，作者进一步将结核杆菌重组抗原Ag85B-ESAT-6和DDA/MMG-1脂质体联合免疫小鼠，诱导了强烈的细胞及体液免疫应答。Rodrigues等[8]以沙眼衣原体主要外膜蛋白(major outer membrane protein，MOMP)为抗原，以纳米颗粒(CAF04)为佐剂，诱导小鼠产生了显著增强的特异性Th1及Th17型细胞免疫应答。

1.3 DDA-MPL DDA-MPL是由阳离子表面活性剂DDA和免疫调节剂单磷酰脂质A(Monophosphoryl lipid A，MPL)组成的阳离子脂质体[4]。DDA对树突状细胞(Dendritic cells, DC)的成熟无直接影响，含MPL 或TDB的DDA可将病原菌相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMP)递送至DC膜上的受体，从而增强免疫刺激作用；MPL是脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)的衍生物，但毒性比LPS要小100倍以上[4]。MPL可激活TLR4并触发Trif依赖的细胞内信号转导途径[22]，且已被批准作为佐剂用于人乳头瘤病毒及乙型肝炎病毒疫苗[4]。

Yu等[4]用鼠衣原体PmpG蛋白作为抗原，平行比较5种不同佐剂，即DDA-MPL、CAF01、CAF04、CpG和明矾的免疫保护作用。在所测试的佐剂中，DDA-MPL和CAF01脂质体通过诱导小鼠产生高水平共表达IFN-γ和TNF-α的CD4+T细胞而引起最大程度的免疫保护。基于这一发现，该学者进一步选择DDA-MPL作为佐剂，检测鼠衣原体13种不同T细胞抗原的疫苗保护作用，发现有7种抗原(PmpG、PmpE、PmpF、Aasf、RplF、TC0420和TC0825)优于或等于衣原体主要外膜蛋白MOMP的保护性。

1.4 CAF09 阳离子佐剂配方9(CAF09)主要由表面活性剂DDA组成，此外还含有一定量的单霉酰基甘油类似物MMG-1及Poly(I：C)，后两种成分可稳定复合物的构型[23]。MMG-1可刺激人的抗原递呈细胞DC，而DDA能促进Poly(I：C)向DC的递送[24]。CAF09可诱导并增强Th1型细胞免疫应答，有实验证明CAF09还能非特异性激活CD8+T细胞[25]。

Pal等[23]将佐剂CAF01或CAF09分别与鼠衣原体天然MOMP或重组MOMP(nMOMP或rMOMP)混合，制备了4组疫苗制剂，采用先皮下再滴鼻的方式免疫接种BALB/c小鼠后，再用活衣原体滴鼻感染进行攻击；结果发现四种疫苗制剂均能诱导小鼠产生高滴度的抗MOMP特异性抗体，T细胞试验证实四组小鼠也产生了强大的细胞免疫应答，T细胞分泌高水平的IFN-γ、IL17及低水平的IL-4；活衣原体感染后，四组小鼠的体重损失明显少于未免疫组，其中接种CAF01、CAF09和nMOMP的小鼠肺组织衣原体含量显著低于rMOMP接种组。研究结果证实CAF01和CAF09是有效的疫苗佐剂，能引起非常强的保护性体液及细胞免疫反应，接种nMOMP的小鼠明显比接种rMOMP的小鼠具有更好的保护作用，表明衣原体MOMP的空间构象对免疫保护也有重要影响。

2 多聚体微粒

多聚体是由单体分子相互结合而成，不同类型的多聚体性质和功能有所差异。目前，用作衣原体疫苗的多聚体佐剂分为两类，即天然多聚体如壳聚糖、化学合成多聚体如PLGA以及多种聚合体如自组装六聚体和穹窿纳米胶囊。与衣原体疫苗研发相关的多聚体佐剂及特点见表2。

表2 多聚体佐剂的特点

2.1 壳聚糖 壳聚糖是一种天然阳离子多糖，具有生物相容性、可降解性和黏膜粘附性等良好性能；但壳聚糖不溶于水，原因是壳聚糖的相邻分子通过氢键连接[12]。为弥补壳聚糖不溶于水的特性，Pawar等[26]首次制备乙二醇壳聚糖(Glycol chitosan，GC)纳米粒子并评估了其佐剂作用，体外实验证实GC平均粒径约为200 nm，表面带正电荷，具有>95%的负载效率，装载乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)，可维持抗原的结构完整性，体内实验发现与壳聚糖纳米粒子相比，GC的鼻腔清除率更低，黏膜吸收更好。除鼻腔外，壳聚糖也可延长并维持抗原在其他不同黏膜系统中的停留时间[27]。此外，壳聚糖还具有高表面积与体积比以及在一系列离子条件下的稳定性，这使其适用范围更加广泛[7]。壳聚糖纳米粒子包埋的抗原可增强呼吸道黏膜局部SIgA反应并在感染动物中提供有效保护[28]。由于壳聚糖所具备的各项优点，美国食品药品监督管理局(FDA)已批准将该聚合物用于伤口敷料和组织工程中[29]。近年来，还发现TMC比未经化学改性的壳聚糖具有更强的抗菌性，其中电荷和化学结构可影响季铵化壳聚糖衍生物的活性[30]。

Li等[31]将基于鹦鹉热衣原体CPSIT_p6和MOMP的多表位肽疫苗佐以壳聚糖纳米粒子，进行肌肉和滴鼻联合免疫，诱导小鼠产生了针对鹦鹉热衣原体的强烈体液、细胞及黏膜免疫应答，并显著降低小鼠肺组织的鹦鹉热衣原体载量。Wern等[32]将一种衣原体抗原与LPN/CAF01经皮下和滴鼻两种途径同时接种免疫小鼠，发现免疫能促使小鼠阴道局部产生SIgA，但不能检测到黏膜T细胞被招募，Rose等[12]用具有黏膜粘附性的乙二醇壳聚糖GC包覆LPN后作为佐剂，与沙眼衣原体抗原 CTH522经滴鼻途径免疫小鼠，诱导小鼠产生了全身及黏膜局部体液免疫应答。细菌菌影是通过诱导噬菌体裂解基因在G-细菌中表达所获得的没有胞质内容物的空菌，由于其保留了与活菌相似的天然表面抗原及生物粘附特性，具有内在佐剂性质，可用来装载外来抗原递送给免疫系统。Jiao等[33]发现菌影作为淋病奈瑟球菌DNA的递送载体，可诱导较强的系统抗体应答和细胞免疫应答。Zuo 等[34]将壳聚糖纳米颗粒配制的灭活衣原体疫苗，与霍乱弧菌菌影(Vibrio cholerae ghosts，VCG)或CpG佐剂混匀后，分别经滴鼻或肌注途径接种SPF级鸡；免疫分析显示，VCG佐剂疫苗配方接种组比CpG组诱导更高水平的IFN-γ反应，VCG佐剂组咽部衣原体清除率高，且肺部病变轻。可见，具有黏膜粘附性的VCG可增强壳聚糖递送载体的佐剂能力，且黏膜免疫也可作为衣原体疫苗设计的重要考虑因素之一。

2.2 含脂质植物三醇和单霉酰基甘油-1的六聚体 六聚体(Hexosomes)是内部结构化的颗粒，由重复的单体棒状排列聚合而成，其每个单体均为六边形的胶束，六边形内填充有封闭的含水通道；六聚体的内表面积大，从而使得药物的包封率更高[9,35-36]；而其他微粒系统(例如脂质体)的疫苗在开发过程中通常遇到包装限制[9-10]。由于富含脂质的环境和水通道网络，六聚体可以容纳疏水、亲水和双亲性分子，疏水性分子往往纳入脂质结构域，而亲水性药物则存在于水通道中，因此，六聚体可作为各种粒度和极性分子的递送系统[9-10,36]。

基于反向六边形液晶相(六聚体)的纳米载体，其独特的内部结构理论上应该比层状液晶相的纳米载体能够更好的容纳抗原和不同理化特性的免疫增强化合物。Rodrigues等[8]首次提出假设，纳米结构对佐剂本身和疫苗活性可能产生影响。为证实这一点，该团队设计了含有脂质植物三醇(Lipid phytantriol，Phy)和免疫增强剂单霉酰基甘油-1(MMG-1)的六聚体；小角X射线散射(Small-angle X-rayscattering，SAXS)和低温透射电子显微镜(Cryogenic transmission electron microscopy，Cryo-TEM)证实Phy和MMG-1可以自组装成具有内部六边形液晶相的纳米载体；为研究纳米结构对佐剂活性的影响，研究者以沙眼衣原体MOMP为抗原，以六边形液晶纳米颗粒(Phy/MMG-1)或层状液晶纳米颗粒(CAF04)为佐剂，结果显示，六聚体纳米颗粒比层状的CAF04诱导了更强的抗MOMP特异性体液免疫，而基于CAF04的疫苗配方诱导了更强的抗MOMP特异性Th1及Th17型细胞免疫，研究结果表明纳米结构对佐剂活性有明显影响，两种佐剂可能通过不同的机制激活免疫系统。

2.3 PLGA 聚DL-乳酸-羟基乙酸(PLGA)是由乳酸和羟基乙酸两种单体分子随机聚合而成的高分子有机化合物。由PLGA组成的纳米粒子因具备生物降解性、生物相容性以及良好的胶体稳定性，引起人们的广泛关注；PLGA已获得美国FDA批准用于生物医学领域[12]。体液免疫应答起始于APC对抗原的识别和内化，如DC和B细胞。Hu等[37]证实PLGA组装的尼古丁疫苗可被DC迅速捕获并内化。并且，PLGA及其衍生物，因安全性、生物降解性和生物相容性等特性，也成为研究最多的疫苗抗原递送系统[38]。

Rose等[39]用脂质体CAF01的组成成分DDA和 TDB修饰PLGA纳米粒子后，发现这种脂质体-聚合物复合纳米粒子(Lipid-polymer hybrid nanoparticles，LPN)提供了针对衣原体MOMP的保护性体液免疫应答，并诱导了Th1/Th17偏向的细胞免疫，但对黏膜免疫系统的激发作用不明显。几年后，Rose等[12]又设计了一种由乙二醇壳聚糖(GC)包覆的PLGA佐剂，经滴鼻免疫后，该佐剂不仅可以增强针对沙眼衣原体重组融合抗原CTH522的黏膜免疫应答，且诱导了与LPN佐剂相同水平的血清抗体及T细胞反应，表明以壳聚糖包覆LPN的佐剂经黏膜途径递送抗原是一种有前景的疫苗策略，可调节黏膜免疫反应的强度。Sahu等[40]用多聚体PLGA负载沙眼衣原体重组MOMP(rMOMP)，体外刺激小鼠骨髓来源DC，可增强DC内体对MOMP抗原的加工，并诱导Th1型细胞因子(IL-6和IL-12p40)、MHC-II类分子和共刺激(CD4、CD80和CD86)分子的表达；PLGA-rMOMP体内免疫小鼠，可诱导MOMP特异性CD4+记忆T细胞、效应T细胞及抗体的产生；生物示踪分析显示PLGA-rMOMP在体内定位于淋巴结，提示通过DCs从注射部位迁移。2021年，Sahu 等[41]进一步将PLGA-rMOMP疫苗经皮下或滴鼻途径免疫小鼠，发现两种途径产生的抗体均能体外中和鼠衣原体对McCoy成纤维细胞的感染性，其中皮下免疫激发的细胞及体液免疫应答更强，能更好的保护小鼠抵抗鼠衣原体的阴道感染及重复感染。以上研究证明PLGA纳米衣原体疫苗可激活DCs,增强对衣原体抗原的特异性应答并保护宿主抵抗衣原体生殖道感染，为临床开发衣原体纳米疫苗提供了可能。

2.4 穹窿纳米胶囊 纳米胶囊是指粒径以纳米为单位衡量的微囊，兼有微囊和纳米粒子的优点。在生物体整个进化过程中，穹窿具有保守性，在哺乳动物锥体虫内发现，由3种蛋白质多拷贝和一种小的非编码的RNA多拷贝组成。主要穹窿蛋白(Major vault protein，MVP)大小约97 kDa，是含量最丰富的穹窿蛋白质，每个穹窿存在多个拷贝；使用杆状病毒系统在昆虫细胞中表达MVP，可形成完整的穹窿状颗粒；但该穹窿缺乏2种高分子量的穹窿蛋白(TEP1和VPARP)和穹窿RNA，不如天然穹窿坚硬[42]。添加富含半胱氨酸标签修饰MVP分子(cp-MVP)可增加其稳定性[43]。

Champion等[44]设计了穹窿纳米粒子(Vault Nanoparticle)装载鼠衣原体抗原，具体为将衣原体的MOMP抗原包裹在空心穹窿纳米胶囊中。制备的MOMP-Vault纳米疫苗经滴鼻免疫小鼠可抵抗衣原体感染，显著减轻攻击后的细菌载量；穹窿免疫可诱导抗衣原体免疫反应和炎症小体形成，但不能激活Toll样受体；此外，MOMP-vault免疫增强了衣原体清除，且不出现与佐剂接种相关的炎症反应。总之，含有免疫原性蛋白的穹窿纳米胶囊经鼻内途径输送到呼吸道可作为“智能佐剂”，诱导远处黏膜局部的保护性免疫应答，同时避免病理性炎症反应的产生。

3 结语与展望

衣原体仍是世界上性传播疾病和感染性致盲的主要原因，筛查和抗生素治疗并未使感染减少；而且抗生素治疗可能会使患者停止自然免疫反应，从而导致感染的播散。疫苗开发为解决该问题提供了方案，其中亚单位疫苗是目前衣原体疫苗研究的重点，但接种后，仍不能提供完全的保护力，因此，需要有效的佐剂或递送系统以加强疫苗的利用效率、提高疗效、降低成本、减少毒副作用，甚至开辟出新的高效免疫接种方式。纳米医药的发展为研究衣原体疫苗开辟了新途径，虽然性质且成分单一的衣原体纳米疫苗所提供的佐剂优势相对有限，但对不同纳米粒子进行物理化学改性或组装形成的纳米疫苗，能充分发挥各自的独特优势，从而表现出更为突出的保护作用，为开发高效的衣原体疫苗提供新思路。

利益冲突：无

引用本文格式：谢丽娟，谢小平，孙珍洁，等.衣原体纳米疫苗的研究进展[J].中国人兽共患病学报，2022，38(1)：48-54，61.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.169