温脾汤对脓毒症大鼠肠黏膜屏障功能保护作用及其机制研究

黄建华，黄光辉，黄 河

（广东省清远市中医院心血管内科，广东 清远 511500）

脓毒症并发症多，病死率可达30%～70%，临床救治困难[1]。肠道被认为是脓毒症诱发多器官功能障碍的启动器官，其中保护肠道屏障功能是脓毒症治疗的重要途径[2]。本课题组临床观察发现温脾汤对脓毒症，尤其是肠道功能障碍有较好的治疗作用，但具体机制尚未阐明。本课题组探究温脾汤对脓毒症大鼠的肠道屏障功能的保护作用及其机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

选择S P F级雄性S D大鼠5 0只，质量（200g±20）g，由广东省动物实验中心提供。饲养环境：室温22～26℃，相对湿度 40%～70%RH。

1.1.2 实验药物

温脾汤（大黄12g，茯苓15g，人参10g，当归10g，制附子10g，白术10g，枳壳10g，干姜9g，芒硝3g，炙甘草6g，每剂煎至100mL，1.03g/mL），由清远市中医院制剂室提供。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制备

脓毒症动物模型建立采用国际公认的鼠类盲肠结扎穿孔（CLP）脓毒症模型。 假手术组：剖腹后只在盲肠根部穿入丝线，不行结扎和穿孔。

1.2.2 分组与给药

将大鼠称重后按阿拉伯数字编号，按随机原则平均分为5组：模型组（n=10，1号-10号）、假手术组（n=10，11号-20号）、中药高剂量组（n=10，21号-30号）、中药中剂量组（n=10，31号-40号）、中药低剂量组（n=10，41号-50号）。药物剂量以成人用药剂量按实验动物体型系数换算法计算，参照陈奇主编的《中药药理实验方法学》，得温脾汤5.3g/（kg·d），设为低剂量组，而中剂量和高剂量分别为低剂量的2倍和4倍，即10.6g/（kg·d）和21.2g/（kg·d）。中药治疗组造模后每剂药按相应剂量中药均加生理盐水稀释至9mL，分3等份，分别于术后 3h、11h、19h、27h、35h、43h（q8h）灌胃，其余均同时以等量生理盐水干预，在制模后 24h 处死各组编号前5只大鼠、制模48h处死各组剩余大鼠，处死后立即取相应血液及组织标本。

1.3 观察指标

利用采血针连接真空采血管从大鼠腹主动脉取血3～4mL，室内常温下放置1h后，在4℃条件下离心处理（3000r/min），将血清放置在冰箱（-20℃）中待用。采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）分析法测定血清D-乳酸、IL-17水平。

取完血后处死大鼠并在无菌条件下迅速开胸收集实验所需各组织。在距回盲瓣2～3cm处截取约5cm的小肠组织，用生理盐水充分冲洗，确保肠内黏液及粪便冲洗干净后，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗液再次洗涤，并剔除位于肠壁的淋巴结，冲洗洗涤3次后，冲洗干净后，观察肠管外观及浆膜形态，用手术剪将回肠组织剪分为3份，分别用于光镜下观察回肠组织形态学变化，以及ELISA分析法检测肠道上皮细胞sIgA蛋白表达。

切开幼鼠腹腔，取结肠内容物立存于80℃冰箱保存备用以检测幼鼠肠道菌群的变化。采集并准确称量肝、肠系膜淋巴结各1g，检测大鼠肠道细菌移位率。

即刻分离出脾组织，取绿豆大小脾脏放入PBS中，以备流式细胞实验检测Treg、Th17细胞；整个过程严格遵守无菌操作原则。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0版统计软件包处理数据。计量资料以（±s）表示；两组数据间比较用t检验，多组数据间用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组血清D-乳酸、IL-17水平比较

相较于假手术组，模型组血清D-乳酸、IL-17水平均下降，差异有统计学意义（P＜0.05），提示试验造模成功。相较于模型组，中药高剂量组、中剂量组、低剂量组血清D-乳酸、IL-17水平均更低，且随着剂量的增加，水平越低，差异均有统计学意义（P＜0.05），说明温脾汤对大鼠血清D-乳酸、IL-17水平有一定的影响。见表1。

表1 3组血清D-乳酸、IL-17水平比较 （±s）

表1 3组血清D-乳酸、IL-17水平比较 （±s）

组别 鼠数 D-乳酸（mmol/L） IL-17（ng/L）假手术组 10 3.12±0.71 691.23±45.81模型组 10 2.80±0.62 612.75±41.06中药低剂量组 10 2.03±0.54 452.38±37.94中药中剂量组 10 1.76±0.48 425.68±35.42中药高剂量组 10 1.51±0.40 410.85±32.04 F 112.680 62.304 P 0.000 0.000

2.2 各组s Ig A蛋白表达比较

相较于模型组，各组s Ig A蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05），但各用药组均有所降低，提示温脾汤能在一定程度上调节大鼠的免疫球蛋白水平，减轻机体免疫反应。见表2。

表2 3组ZO-1蛋白和s Ig A蛋白表达的比较 （ug/mL，±s）

表2 3组ZO-1蛋白和s Ig A蛋白表达的比较 （ug/mL，±s）

组别 鼠数 IgA IgM IgG假手术组 10 11.21±2.36 7.52±1.36 8.52±1.69模型组 10 11.57±2.38 6.97±1.32 7.42±1.38中药低剂量组 10 11.34±2.37 7.04±1.33 7.23±1.35中药中剂量组 10 11.06±2.32 6.89±1.31 7.10±1.34中药高剂量组 10 10.98±2.30 6.74±1.30 7.02±1.33 F 0.645 0.720 0.583 P 0.142 0.285 0.347

2.3 各组Treg和Th17细胞含量比较

相较于模型组，中药低、中、高剂量组Treg和Th17细胞含量均更高，差异有统计学意义（P＜0.05），且中药低、中、高剂量组之间呈明显上升趋势。见表3。

表3 3组Treg和Th17细胞含量的比较 （%，±s）

表3 3组Treg和Th17细胞含量的比较 （%，±s）

组别 鼠数 Treg（%） Th17（%）假手术组 10 4.02±0.32 1.76±0.34模型组 10 4.87±0.39 2.03±0.40中药低剂量组 10 5.24±0.47 2.85±0.49中药中剂量组 10 5.86±0.53 3.76±0.53中药高剂量组 10 5.97±0.56 4.41±0.60 F 42.517 63.290 P 0.000 0.000

3 讨 论

脓毒症Sepsis是指宿主对感染产生的失控反应并出现危及生命器官功能障碍的临床综合征，并发症多，病死率高达30%～70%，ICU住院时间长，花费高[3]。脓毒症发生时，炎性反应致炎症因子增加，肠道内环境平衡紊乱，肠上皮细胞凋亡增多，肠道黏膜屏障受到破坏，肠黏膜通透性发生改变，致使肠道菌群失调，内毒素入血，免疫系统失调，进而引发全身炎症反应，危及患者生命[4]。肠道被认为是诱发多器官功能障碍的启动器官，其中肠道屏障，包括机械屏障、生物屏障与免疫屏障，在脓毒症的发生发展过程中起重要作用[5]。

温脾汤出至唐《千金备急方》，主治脾阳不足、阴寒内盛、寒积中阻证，是温下剂的代表方。全方不仅能温补脾阳，而且能除瘀血、涤荡积滞、调理气机，标本兼顾，攻补兼施，使邪去而正易复，直切脓毒症胃肠功能障碍病机所在。既往研究证实，温脾汤对脓毒症，尤其是肠道功能障碍有较好的治疗作用，但具体机制尚未阐明[6-8]。本研究结果显示，温脾汤对大鼠肠黏膜屏障功能可起保护作用，其中血清炎症因子的水平经干预后明显下降，提示温脾汤对大鼠血清D-乳酸、IL-17的表达可起到抑制作用；对免疫系统相关指标分析发现，经温脾汤干预后，Treg和Th17细胞含量明显上升，而各免疫球蛋白尽管无明显变化，但各用药组均有所降低，提示温脾汤能在一定程度上调节大鼠的免疫球蛋白水平，减轻机体免疫反应。

综上所述，温脾汤对脓毒症大鼠肠黏膜屏障可起到保护作用，其机制可能与抑制炎症因子表达、调节免疫系统有关。