UV-B辐照对特早熟柑橘采后果皮色素的影响

杨 慧， 郭世泽， 伍 峥， 孙志伟， 唐天睿， 杨学虎

(1.云南农业大学 园林园艺学院， 云南 昆明 650100； 2.云南农业大学 热带作物学院， 云南 普洱 665000)

0 引言

【研究意义】紫外线可分为长波紫外线(UV-A，400～320 nm)、中波紫外线(UV-B，320～280 nm)和短波紫外线(UV-C，280～180 nm)[1]。其中，UV-C被臭氧层吸收，无法到达地面；UV-A虽能到达地面，但无明显的生物学效应；UV-B能透过臭氧层到达地面，对植物产生有效辐射，显著影响其生长发育[2]。柑橘(Citrus)是芸香科(Rutaceae)植物，属亚热带、热带常绿果树，为全球第一大类果品、第三大国际贸易农产品[3]，是重要的经济作物之一。云南气候条件多样，柑橘产业迅猛发展，宽皮柑橘类品种处于主导地位，由于得天独厚的气候优势，筛选出兴津、日南等早熟品种。早熟品种果实发育期较短[4-5]，从而导致其品质不佳，尤其是外观品质，在果实着色期缺乏光照，使果实不能很好地完成转色，严重影响其经济价值。因此，在生产实践中寻求改善特早熟柑橘外观品质的采后处理技术具有重要的现实意义。【前人研究进展】近年来，利用紫外线采后处理果实的研究越来越多。紫外线辐照是影响植物体内叶绿素和类胡萝卜素合成积累的重要因子，利用适宜的辐照对柑橘果实进行采后处理可有效改善其外观品质，如增强UV-B辐照可改善柠檬[6]、杧果[7]和桃[8]的外观品质。LIU等[9]研究表明，UV-B辐照可有效保持番茄采后感官品质并提高其抗氧化能力；IBDAH等[10]研究表明，离体UV-B辐照处理可以提高苹果的营养价值和外观品质但其味道未发生改变。【研究切入点】目前，有关UV-B辐照对特早熟柑橘采后果皮色素的影响研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】以云南特早熟柑橘兴津为试材，探究不同UV-B辐照处理对其果皮色素的影响，以期为云南特早熟柑橘采后外观品质的改善提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料 特早熟柑橘品种兴津，由华宁县农业局亚热带水果示范园提供。

1.1.2 试剂 植物RNA提取试剂盒，购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；cDNA合成试剂盒，购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司；实时荧光定量试剂盒，购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司。

1.2 试验方法

试验在云南省玉溪市华宁县华溪镇柑橘示范基地进行，于采收期采摘一批大小、形态、色泽品质均一的柑橘果实，在5℃、相对湿度85%贮藏条件下，用波长308 nm的UV-B灯管进行照射，通过调节光源距离设置辐照强度为100 μW/cm2，分别照射0 h(CK)、24 h和48 h。每隔10 d(0 d、10 d、20 d、30 d)从照射0 h、24 h、48 h处理中随机选取3个果实样品，测定其果皮色差、色素(叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素)含量及色素代谢相关基因的相对表达量。

1.2.1 果实色差测定 用3nh精密色差仪(NR110，三恩时科技有限公司)测定果皮色差，测定位置为果实赤道2点、顶部1点和底部1点，取平均值；测定L值(光泽明亮度，值越大代表越明亮)、a值(红绿指标，正值为红色程度、负值为绿色程度)和b值(黄蓝指标，正值为黄色程度、负值为蓝色程度)。

1.2.2 果皮色素测定 用丙酮︰乙醇︰水=4︰4︰1混合液提取叶绿素和类胡萝卜素，用分光光度计〔A580,翱艺仪器(上海)有限公司〕在662 nm、645 nm、470 nm测定叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的吸光值，利用公式计算其含量[11]。

叶绿素a=12.72A662-2.59A645

叶绿素b=22.88A645-4.67A662

类胡萝卜素=(1 000A470-3.27Ca-104Cb)/229

式中，A代表吸光值，Ca代表叶绿素a含量，Cb代表叶绿素b含量。

1.2.3 基因表达量测定 RNA的提取使用植物RNA提取试剂盒，反转录使用cDNA合成试剂盒。RNA提取后用1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测RNA纯度和浓度，用2 μL的RNA模板和20 μL反应体系进行cDNA合成，于—20℃冰箱保存备用。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)使用荧光定量PCR仪(QuantStudio5，Applied Biosystems)、荧光定量试剂盒测定。β-actin基因为内参基金，引物为F(CCAAGCAGCATGAAGATCAA)和R(ATCTGCTGGAAGGTGCTGAG)，基因引物序列见表1。反应体系：cDNA 2 μL，Hieff qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，正反向引物各0.4 μL，ddH2O 7.2 μL，总体系20 μL。反应程序：95℃预变性5 min；95℃变性10 s，60℃退火(延伸)30 s，40个循环。溶解曲线阶段使用仪器默认设置，每个样品设3次重复。测定结束后利用2-ΔΔCT法分析相对表达量。

表1 基因引物序列

1.3 数据统计分析

采用Excel 2010和DPS对数据进行统计分析，用Duncan新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 UV-B辐照处理特早熟柑橘采后果皮的色差

由图1可知，不同辐照处理果皮色差随贮藏时间变化。L值：辐照0 h和24 h贮藏0～10 d时均呈降低趋势，分别下降0.40和0.94；贮藏10 d后，L值升高，分别增加1.09和1.21，0 h与24 h的L值差异不显著。辐照48 h随贮藏时间增加L值显著升高，增加2.30；48 h的L值显著高于0 h和24 h。a值：辐照0 h、24 h和48 h贮藏0～10 d时均显著升高，分别增加15.77、12.63和13.22；贮藏10 d后各处理a值变化不明显，保持在较为平稳阶段。b值：0 h和24 h贮藏0～10 d时略有降低，分别降低0.18和0.44；贮藏10～30 d时分别增加2.64和0.52，差异均不显著。辐照48 h的b值随贮藏时间增加而升高，贮藏30 d时显著增加5.27，且显著高于0 h和24 h。综合看，辐照0 h、24 h、48 h贮藏0～30 d，L值、a值、b值总体上随贮藏时间增加而升高，其中，辐照48 h的L值、b值显著高于0 h和24 h。

注：不同小写字母表示差异达显著水平(P<0.05)，下同。

2.2 UV-B辐照处理特早熟柑橘采后果皮的色素

从图2看出，叶绿素a：辐照0 h和48 h贮藏0～20 d时呈升高趋势，分别增加0.86和0.33；贮藏20 d后呈降低趋势，分别降低2.64和1.23。辐照24 h贮藏10 d时含量最高，为3.59，随着贮藏时间增加呈降低趋势，贮藏30 d时降至1.37。辐照24 h和48 h的叶绿素a含量与0 h呈显著性差异，辐照24 h的叶绿素a含量与48 h差异不显著。叶绿素b：辐照0 h贮藏0～20 d时无显著差异，贮藏30 d后显著降低。辐照24 h随贮藏时间增加叶绿素b含量呈先升后降趋势。辐照48 h贮藏0～10 d时叶绿素b含量呈降低趋势，贮藏10～30 d时呈先升后降趋势，且差异均不显著。类胡萝卜素：辐照0 h、24 h和48 h均随贮藏时间增加类胡萝卜素含量呈先升后降趋势，均在20 d时达最大，分别为0.90、1.12和1.00；与0 d、10 d时差异显著。综上，辐照0 h、24 h、48 h的叶绿素a、叶绿素b含量随贮藏时间增加呈降低趋势，以辐照24 h和48 h处理最佳；辐照0 h、24 h和48 h的类胡萝卜素含量随贮藏时间增加均呈先升后降趋势，在20 d时达最大。

图2 UV-B辐照处理特早熟柑橘采后果皮的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量

2.3 UV-B辐照处理特早熟柑橘采后色素代谢基因的相对表达量

由图3可知，不同UV-B辐照处理柑橘果皮中色素代谢基因的相对表达量存在差异。其中，叶绿素降解途径的关键基因PaO和RCCR均呈升高趋势，其相对表达量均依次为48 h>24 h>0 h。类胡萝卜素合成途径的关键基因PSY的相对表达量为48 h处理高于0 h和24 h处理。表明，采后UV-B辐照处理可促进特早熟柑橘贮藏期脱绿(叶绿素降解)，辐照48 h有利于贮藏期果皮类胡萝卜素的累积，对提高色泽品质具有重要作用。

图3 UV-B辐照处理特早熟柑橘采后色素代谢基因的相对表达量

3 讨论

柑橘果皮颜色主要由果皮所含的叶绿素、类胡萝卜素的种类和含量决定。其中，类胡萝卜素是1种数量庞大的化合物家族，且类胡萝卜素所赋予果实的颜色较绿色更受消费者青睐[12]。UV-B辐照处理后破坏叶绿体结构，而类胡萝卜素作为一种植物光合作用的保护剂，可随叶绿素降低而升高，从而对叶绿素起保护作用[13]。研究结果表明，UV-B辐照0 h、24 h和48 h贮藏0～30 d时特早熟柑橘果皮色差的L值、a值和b值总体随贮藏时间增加而升高，其中，辐照48 h的L值、b值显著高于0 h和24 h；果皮色素的叶绿素a和叶绿素b含量随着贮藏时间增加而降低，但降幅均较0 h高；类胡萝卜素含量随贮藏时间增加而增加，且在贮藏20 d时达最大，与张文会等[14-15]的研究结果一致。根据果皮色素代谢基因的相对表达量，推断UV-B辐照处理对贮藏期柑橘果皮叶绿素的降解具有促进作用，辐照48 h可有效促进贮藏期果皮中类胡萝卜素的积累，辐照0 h和24 h的基因PSY的相对表达量差异不显著，推测辐照24 h未达到促进果皮类胡萝卜素积累的辐照剂量。综合看，UV-B辐照对柑橘果实的色泽具有明显促进作用。

4 结论

特早熟柑橘采后UV-B辐照剂量不同对果皮色泽的影响不同，辐照显著提高果皮的明亮度和黄色度，降低叶绿素含量而提高类胡萝卜素含量；提高PaO、RCCR和PSY基因的相对表达量，促进特早熟柑橘贮藏期脱绿(叶绿素降解)，辐照48 h有利于果皮贮藏期类胡萝卜素的累积，对提高贮藏期的色泽品质具有重要作用。综上，在果实贮藏期间适度增加UV-B辐照可有效改善特早熟柑橘果实的表皮色泽，以UV-B辐照48 h贮藏20 d最佳。