一例猪圆环病毒3 型与猪繁殖与呼吸综合征病毒共感染的诊断

邱 萍 仙游县度尾畜牧兽医技术服务站 福建仙游 351200

猪圆环病毒3 型（PCV3）于2015 年美国猪群中首次发现，此后PCV3 迅速在世界范围内流行，中国猪群流行病学调查显示68.6%猪群呈PCV3 感染抗体阳性[1]。该病毒常与猪圆环病毒2 型（PCV2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（ PRRSV）和（或）猪瘟病毒（CFV）共感染，严重损害猪只呼吸道、消化道和生殖系统[2-3]。 PCV3 与PRRSV 共感染的猪群，临床表现为母猪流产、产死胎，机体消瘦，呼吸道症状明显[4-6]。现介绍一例PCV3 与PRRSV 共感染病例的诊断情况，为今后该类疾病的诊治提供参考。

1 病例介绍

2021 年4 月， 福建某猪场母猪群陆续出现流产、产木乃伊胎，流产率30%左右。 保育猪群出现食欲不振、被毛粗糙、消瘦、呼吸困难等临床症状，发病率60%。

2 临床症状及剖检病变

患猪被毛粗糙，呼吸困难（见图1A）。 发病母猪流产，流产胎儿日龄90~100 d（见图1B），剖检病死猪见肺脏胰样肉变， 呈斑驳状， 质地如橡皮（见图1C）， 腹股沟淋巴结、 肺门淋巴结明显肿大 （见图1D）。

图1 送检患猪剖检结果

3 实验室检查

3.1 主要试验器材及试剂 仪器：PCR 基因扩增仪（宁波市双嘉仪器有限公司）和小型电泳仪（C.B.S.公司）。 试剂：病毒DNA/RNA 提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司、DNA 凝胶回收试剂盒和反转录试剂盒购自Prommega 生物技术有限公司。

3.2 DNA/RNA 提取 在清洁环境下采集患猪肺脏、脾脏、淋巴结、肾脏等部位的病变组织，每个器官提取的量约为指甲盖大小。 病变组织用放在冰上的匀浆机充分匀浆， 匀浆后的组织置冰箱反复冻融3 次，然后按8 000 r/min 离心15 min 取上清。 按试剂盒操作说明书提取DNA/RNA。

3.3 PCR 扩增 以提取病料DNA 为模板，用PCV2、PCV3 引物进行PCR 扩增，引物序列为PCV2（404 bp）：F: 5′ -CGGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGC-3′, R: 5′-TTA GG GTTTAAGTGGGGGGT-3′；PCV3 （330 bp）：F:5′-CCACAGAAGGCGCTATG TC -3′,R：5′-CCGCATAAGGGTCGTCTTG-3′[7]；以提取病料总RNA 进行反转录获取cDNA； 用PRRSV、CFV 引物进行qRT-PCR 扩增， 引物序列为PRRSV（1 004 bp）：F:5′-CATTTCATACAC CTGAGACCAT-3′, R: 5′-AGATCATATAT CATCACT GGCT-3′[8]；CFV （184 bp）: 5′-ATCAGTCTCTGGAATTGTTGG CA-3′,R: 5′-CA AGCACGGATGAGGAATGCCG-3′，扩增的反应体系见表1。

表1 PCR 扩增反应体系及程序

将PCR 扩增产物加入1%琼脂糖凝胶点样孔，在120 V 条件下凝胶电泳45 min，在凝胶成像系统中观察并拍下凝胶图像，PCR 产物送福州擎科生物科技有限公司测序。

3.5 基因同源性及遗传变异分析 用生物学软件DNAMAN 将测序结果与NCBI 库GeneBank 的基因进行同源性及遗传进化分析， 了解病毒的遗传变异情况。

4 结果与分析

4.1 PCR 检测结果 对病料样品进行PCR/RTPCR 扩增，从凝胶电泳获得的图像可见，在PRRSV和PCV3 泳道中分别出现1 000 bp 左右和330 bp左右的条带，获得的条带大小与预期相符合。PCV2、CFV 泳道未见明显条带， 在CFV 泳道见模糊杂带，与预期条带大小不符合（见图2）。 PCR/RT-PCR 结果显示送检患猪存在PRRSV 与PCV3 共感染。

图2 送检病料PCR 检测结果

图3 测序结果同源性分析及遗传进化分析结果

4.2 扩增产物同源性及遗传进化分析结果 将RT-PCR/PCR 扩增产物测序结果与GeneBank 筛选的相关基因序列对比可知（见图3），PCV3 测序结果与筛选基因同源性普遍较高， 其中KY996338.1 序列同源性最高， 同源性为99.7%； 与MG87100、MN605935、MT473950 同源性为98.9%， 同源性最低； 通过遗传进化树分析可知，PCV3 测序结果与MK746099 遗传关系最近，与MH547280，MN605935遗传关系最远。 PRRSV 测序结果与 JXA1（EF1124451）序列同源性最低，同源性仅为87.7%；与VR2332（EF536003.1）和MLV（AF159149.1）序列同源性最高，同源性为97.9%。 PRRSV 测序结果与MLV （AF159149.1）、TJ （EU860248.1） 和VR2332（EF536003.1）遗传关系最近，与JXA1（EF112445.1）遗传关系最远。

5 讨论与分析

对送检病料进行核酸检测显示PCV3 和PRRSV 呈阳性， 因此该猪场猪群存在PCV3 与PRRSV 共感染。

5.1 PCV3 感染与PRRS 的临床症状 PRRSV 可经呼吸道和生殖道传播， 传播方式不仅可由怀孕母猪垂直传给胎儿，还能通过粪便、唾液等排出物散播给周边猪群， 而且引带毒种群往往是导致猪群暴发该病的主要原因[9]。 PRRS 暴发时，怀孕母猪出现流产、早产、产死胎等现象；保育猪可能出现食欲不振、呼吸困难并且伴发高热。 对患猪剖检可发现肺部炎症，肺叶出现明显病变，淋巴组织水肿，脾脏发炎等症状[10]。

PCV3 在2016 年首次被发现并报道命名，主要危害的是保育猪群， 该病与PCV2 基因组同源性仅为37%~55%， 该病毒在流产的胎儿皮肤、 肾脏、肺和淋巴结中拷贝数较高[11]。PCV3 在健康猪群也可携带，不一定表现出临床症状，但可能会降低猪群生长速度。 在临床上大多存在PCV3 感染的猪群免疫力会下降，从而使得猪群腹泻率升高，也可能会出现多系统炎症和心肌炎，同时也会有呼吸道疾病、繁殖障碍等症状[12]。

5.2 PCV3 感染的防控 PCV3 传播迅速， 可在家禽、家畜等动物间传播，宿主范围广，还能够同其他病原发生共感染。研究发现，健康状况不佳更容易感染PCV3， 患有重度呼吸道疾病的猪群感染率（63.75%）显著高于轻症呼吸道疾病猪群（13.14%），患有消化道疾病的猪群感染率也显著高于健康猪群[13]。 发病猪和隐性感染PCV3 的患猪是主要传染源，能够通过排泄物、唾液等污染周围环境，最终传染给健康猪群， 感染PCV3 的母猪也会将病毒垂直传播给后代[14]。 目前市面上并无针对PCV3 的特效药，养猪场禁止与其他动物同时饲养；饲养过程中加强饲养管理，提高整体猪群的健康度。将发病猪分群隔离饲养， 定期对母猪群进行PCV3 检测， 及时淘汰检测阳性母猪。

5.3 PRRS 的防控 养殖场应注重建立生物安全防控措施， 加强猪群饲养管理和环境控制。 在引猪时，加强检疫措施，务必避免引入阳性带毒种猪，在日常饲养管理中定期对饲养环境消毒， 采用全进全出饲养模式。 目前市面上有PRRSV 弱毒疫苗和灭活苗，弱毒苗的免疫效果明显优于灭活苗，在防控该病上取得一定成效， 但弱毒苗免疫后存在PRRSV毒力反强风险，在临床上甚至出现接种疫苗后，突然暴发该疾病，因此在考虑使用该疫苗时需综合考虑。