木奶果种质资源的遗传多样性分析及DNA指纹图谱构建

2022-08-09周彩霞罗培四孔方南蒋娟娟卓福昌李文砚

南方农业学报 2022年5期

周彩霞，罗培四，孔方南，蒋娟娟，卓福昌，李文砚，周婧，韦优

（广西农业科学院广西南亚热带农业科学研究所，广西崇左 532415）

0 引言

【研究意义】木奶果（Lour.）为大戟科、木奶果属常绿乔木，产于广东、海南、广西和云南，生于海拔100~1300 m的山地林中，在印度、缅甸、泰国、越南、老挝、柬埔寨和马来西亚等地区也有分布（中国科学院中国植物志编辑委员会，1994），是一种集食用、药用和观赏为一体的热带特色优稀果树（刘明生，2003；徐静等，2007a，2007b；罗培四等，2014）。我国木奶果种质资源丰富，但尚无商业化优良品种，多以野生半野生状态分布（林书生和罗志文，2013；罗浩城等，2017）。因此，明确木奶果种质资源遗传多样性，探讨其亲缘关系，初步构建DNA指纹图谱，对木奶果种质资源的保存、鉴定及优异品种选育具有重要意义。【前人研究进展】目前，关于木奶果的研究报道大多为药用价值分析（Hos‐sain，2017；Nesa et al.，2018；Kumar et al.，2018；郑晓燕等，2018）、成分测定和提取工艺（李文砚等，2015；邓浩等，2016；郭馨欣等，2019）、生理抗性（Bai et al.，2012；Wen et al.，2016）、种质繁育（罗培四，2017；廖美兰等，2020）以及优良单株筛选（罗培四等，2014；陈国德等，2019）等。国内外关于利用分子标记对木奶果进行遗传学相关研究的报道均较少，罗培四（2017）运用SCoT分子标记对37份来自广西、广东、海南和云南的木奶果种质进行遗传多样性和亲缘关系分析分析，结果显示37份种质在9条SCoT引物中扩增获得109个位点，多态位点率为86.24%，表明SCoT分子标记可应用于木奶果的遗传多样性分析，且在木奶果鉴定中具有一定的潜力；Chik‐mawati（2019）通过ISSR标记对木奶果同属的另一个种（）进行了遗传多样性及种群结构分析。目标起始密码子多态性（Start codon tar‐geted polymorphism，SCoT）分子标记是一种基于单引物扩增目的基因的共显性中性分子标记方法，与传统的分子标记相比，其能有效产生与性状连锁的标记，是一种能跟踪性状的新型分子标记，最早由Collard和Mackill（2009）提出并在水稻上应用，因其重复性好、灵敏度高、稳定性强、操作简单、成本较低、引物通用、多态性高、遗传信息丰富等优点（龙治坚，2015）被广泛用于植物资源的研究，如割手密（罗霆等，2013）、芥菜（林清等，2013）、番木瓜（杨祥燕等，2013）、鸭茅（蒋林峰等，2014）、枸杞（查美琴等，2016）、皂荚（张安世等，2017a）、猕猴桃（张安世等，2017b）、柑橘（韩国辉等，2019）、杨桃（欧景莉等，2019）、地黄（杨珂等，2019）等种质资源的遗传多样性研究、亲缘关系研究及指纹图谱构建等。【本研究切入点】虽然罗培四（2017）已采用过SCoT分子标记对部分木奶果种质资源进行遗传多样性分析，但涉及到的种质资源份数较少，且未构建DNA指纹图谱的相关研究报道。【拟解决的关键问题】利用SCoT分子标记对63份木奶果种质资源进行遗传多样性分析，筛选出多态性较高的引物并构建木奶果DNA指纹图谱，以期为木奶果种质资源的分类鉴定、保存和利用提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的63份木奶果种质资源是由本研究课题组从广西、云南、海南和广东收集而来的野生或半野生种质（表1），地理位置为100°47′E~110°02′E，18°04′N~23°06′N，海拔18~1119 m，现嫁接保存于广西南亚热带农业科学研究所的木奶果种质资源圃内。主要试剂：MiniBEST Plant Genomic DNA Extrac‐tion Kit试剂盒、TaKaRaDNA聚合酶以及dNTP Mixture均购自宝日医生物技术（北京）有限公司；其他生化试剂及引物均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。主要仪器设备：梯度PCR仪（Easy Cycler，德国AnalytikJena）、全自动化学发光/荧光图像分析系统（5200Multi，上海天能科技有限公司）、台式冷冻离心机（5430R，德国Eppendorf）和电泳仪（DYCZ-20G，北京六一生物科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取及检测采用MiniBEST植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，并取1.0 μL DNA样品用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测（电压为120V，30 min），将DNA浓度稀释至10 ng/μL，于-20 ℃冰箱备用。

1.2.2 引物筛选及SCoT-PCR扩增从供试材料中选取地理位置相差较远的3个供试材料（种质编号为33、45和61号），分别以三者DNA样品为模板对75条SCoT引物（Collard and Mackill，2009；罗聪，2012）进行筛选，选出条带清晰、重复性好和多态性丰富的6条SCoT引物（表2）用于本研究。SCoT-PCR反应体系：10×PCR Buffer（Mgplus）2.50 μL，10 mmol/L dNTP Mixture 0.50 μL，25 mmol/L MgCl2.0 μL，5 U/μLDNA聚合酶0.13 μL，10 µmol/L SCoT引物1.00 μL，10 ng/μL DNA模板5.00 μL，ddHO补足至25.00 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃50 s，50 ℃1 min，72 ℃2 min，共进行38个循环；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。PCR产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，随后银染显影。

1.2.3 数据分析利用WPS进行数据整理及统计，多肽性信息量（Polymorphic information content，PIC）计算公式为：

其中，为基因座位上第等位基因的频率（段艳凤等，2009）。利用Popgene 1.32计算等位基因数（Observed number of alleles，）、有效等位基因数（Effective number of alleles，）、Shannon’s信息指数（Shannon’s information index，）、Nei’s基因多样性指数（Nei’s gene diversity，）。利用NTsys 2.10e的非加权配对平均法（UPGMA）进行聚类分析。参考聂新辉等（2014）的方法略作修改，将引物在样品中扩增得到的（0，1）数据转化为十六进制数据，该十六进制数据代表每个引物的扩增结果，利用筛选出的引物组合十六进制数字串作为供试种质资源的数字指纹。

2 结果与分析

2.1 SCoT标记多态性检测结果

利用筛选出的6条SCoT引物从63份木奶果种质资源中共扩增出192条条带（表3），其中多态性条带188条，多态性比率为97.86%；每条引物扩增的条带数为26~36条，平均为32条，多态性条带数为26~36条，平均每条引物可扩增出31.33条多态性条带，多态性比率为90.00%~100.00%；PIC为0.9052~0.9527，平均为0.9319，为0.2459~0.3878，平均为0.3238；'为0.1476~0.2412，平均为0.1984；为1.9000~2.0000，平均为1.9786；为1.2324~1.3700，平均为1.3052，说明所筛选的6条SCoT引物的多态性检测效率较高，适用于木奶果种质资源的遗传多样性分析和指纹图谱构建，从而实现种质鉴定。

2.2 遗传相似性及聚类分析结果

利用NTsys 2.10e计算63份木奶果种质资源间的遗传相似系数，结果表明供试材料间的遗传相似系数为0.5781~0.9115，平均为0.7496，变幅为0.3334。其中，亲缘关系最近的是来自广西的2号与3号种质，以及来自海南的59号与61号种质，遗传相似系数最大，为0.9115；亲缘关系最远的是来自广西的32号种质和来自海南的59号种质，遗传相似系数最小，为0.5781。综上所述，亲缘关系的远近或与种质的来源具有一定的相关性，即来自同一地区的种质遗传相似度更高，亲缘关系更近，而来自不同地区的种质亲缘关系更远。

UPGMA法聚类分析结果（图2）显示，63份木奶果种质资源在遗传相似系数0.7100时可分成5组（A~E），其中A组包含1份来自广西龙州县的种质（编号39）和1份来自广西大新县的种质（编号32）；B组为1份来自广西大新县的种质（编号12）；C组为2份来自云南景洪市的资源（编号42和45）和2份来自云南江城县的种质（编号46和49）；D组为6份来自海南和广东的全部种质（编号58~63）；E组为剩余的50份种质。

2.3 DNA指纹图谱初步构建结果

6条SCoT引物扩增出的多态性条带存在明显差异，说明其区分种质资源的种类和数量也各不相同。单条引物可区分的种质份数为49~63份，平均为58份。其中，引物SCoT32可扩增出30条多态性条带，且能单独将供试的63份种质资源全部区分开；其他引物均需两两组合才能将供试的种质资源全部区分开，如引物SCoT49与引物SCoT66组合、引物SCoT49与引物SCoT74组合、引物SCoT66与引物SCoT68组合、引物SCoT66与引物SCoT74组合、引物SCoT68与引物SCoT74组合、引物SCoT73与引物SCoT74组合。

6条SCoT引物对63份木奶果种质资源的扩增结果显示，有13份种质资源具有特征引物，即仅用一条引物就能区分该种质与其他种质。其中，11、13、17、20、25、28、39、40、52和53号种质均各有1条特征引物，23、49和50号种质分别有2条特征引物。在供试的6条SCoT引物中，除了引物SCoT49无特征谱带，其余5条引物均有特征谱带，且一共产生了16条特征谱带（表4加粗部分为含有特征谱带的十六进制数），说明这5条引物可有效用于木奶果指纹图谱的构建。

综合考虑引物扩增的多态性条带数、重复性以及鉴别种质资源的能力等因素，从筛选出的6条SCoT引物中进一步筛选出5条SCoT引物用于木奶果种质资源的DNA指纹图谱构建，以十六进制数代表相应引物下扩增的（0，1）数据（表4）。

3 讨论

多态性是评价分子标记的重要依据，而评价分子标记多态性的主要参数包括DNA扩增的总位点数、多态性位点数、多态性比率、、、PIC等（杨祥燕等，2013；张安世等，2017a，2017b；李琼等，2021）。本研究筛选出的6条SCoT引物对63份木奶果种质资源共扩增出192个位点，多态性位点188个，多态性比率达97.86%，为0.1476~0.2412，平均为0.1984，为0.2459~0.3878，平均为0.3238，平均每条引物的PIC达0.9319，远大于0.5000，说明筛选出的6条SCoT引物在木奶果种质资源中具有较高的多态性，可将其用于木奶果种质资源的遗传多样性分析、DNA图谱构建、种质鉴定及基因定位等工作。

种质资源是遗传育种的物质基础，遗传多样性水平代表了该物种在特定环境中基因的丰富程度（查美琴等，2016），了解种质资源的遗传多样性和亲缘关系，对亲本选配具有重要意义。从分子水平上来说，遗传相似系数越小，变幅越大，则表明该物种的遗传分化越大，遗传多样性越高，遗传背景也就越复杂（苗晗等，2014）。在本研究中，供试的63份木奶果种质资源的遗传相似系数为0.5781~0.9115，变幅为0.3334，大部分种质资源间的遗传相似系数为0.7100~0.7900，占比达63.08%，说明这63份种质的遗传背景较宽且遗传多样性十分丰富；聚类分析结果显示，供试的种质在遗传系数为0.7100时可分为5组，呈现出一定的地域差异，少数相同地理来源的种质亲缘关系较近，但还有大部分不同地区的种质相互混杂，可能是受人类的生产活动以及环境气候因素影响所致（Chikmawati，2019）。同时，本研究供试种质材料地域来源不够丰富，广西的种质39份、云南的种质18份、海南的种质5份、广东的种质仅有1份，且均为海拔1119 m以下的地区，未能完全覆盖木奶果分布的地区，在今后的种质资源收集过程中可适当地拓宽收集范围，以扩充木奶果的种质库；从聚类分析结果可看出，来自广西的2号种质（PDong2）和3号种质（PDong6）、来自海南的59号种质（MG2）和61号种质（NW2）的亲缘关系十分相近，遗传相似系数均为0.9115，说明供试材料中可能存在一部分冗余的种质资源，可能会影响到整个种质资源群体的遗传多样性，但由于现保存的种质仅为1~2年生的嫁接苗，尚未开花结果，未能对其进行系统地形态学观察。在今后的研究中，可结合形态标记对种质资源进行适当地剔除，筛选出具有代表性的种质，构建核心种质群体，为木奶果种质资源的科学保存和开发利用提供理论参考。

DNA指纹图谱出现在20世纪80年代，是指DNA样品经特定的分子标记技术处理所显示出具有特定DNA片段的总称（Vos et al.，1995），是鉴定个体身份的精确方法，在法医学、亲子鉴定及移民身份确定等方面得到广泛应用（郭晓强和冯志霞，2008）。国际植物新品种保护联盟（International Union for the Protection of New Varieties of Plants，UPOV）已将DNA标记的鉴定纳入农作物品种DUS测试内容，我国也将DNA指纹图谱鉴定作为品种质量监控的重要措施之一（苗晗等，2014）。与传统的种质鉴定分类方法相比，DNA指纹图谱能准确、快速地揭示植物种质间的遗传差异，在品种鉴定、品种注册、分辨真假杂种及知识产权保护等方面具有重要的作用（杨祥燕等，2013）。DNA指纹分析的方法主要有特征谱带法、引物组合法和核心引物组合法（王凤格等，2003；王辉丽等，2022）。本研究中，引物SCoT32、SCoT66、SCoT68、SCoT73和SCoT74均可扩增特征谱带，能单独将某份种质从供试的63份种质资源中区分出来，其中，引物SCoT32虽然只有一条特征谱带，但仅通过引物SCoT32就能将所有供试材料区分开来，说明引物SCoT32可作为鉴别木奶果种质资源的核心引物。随着收集种质数量的不断增多，种质间的亲缘关系可能会更近，差异更小，引物SCoT32的鉴别能力可能会渐渐减弱，这时就需要增加新的引物对种质进行区分，结果发现，引物SCoT66、SCoT68、SCoT73和SCoT74通过两两组合的方式也能将供试的63份种质资源全部区分开，表明利用筛选出的5条引物组合初步构建木奶果种质资源的DNA指纹图谱具有一定的合理性，在今后的木奶果种质资源鉴定和DNA指纹图谱构建工作中可优先考虑以上5条引物。本研究仅仅运用SCoT分子标记对63份木奶果种质资源进行初步分析，今后仍需结合多种分子标记以及形态学、细胞学、同工酶等方法进行深入探讨，为木奶果种质资源的分类鉴定、保存利用以及筛选核心种质等工作提供更科学可靠的依据；同时，也需要制定更完善的木奶果种质资源评价体系，将种质资源收集范围扩大到国内更多地区以及印度、缅甸等国外地区，做到应保尽保，建立木奶果核心种质资源圃。