结肠癌术后感染患者外周血中CK19 mRNA转录与蛋白表达的意义

李恒 张东辉 刘丹璐

(西安市中心医院结直肠外科，陕西 西安 710001)

结肠癌位居胃肠道肿瘤发病率的第三位，严重威胁人类生存健康。目前结肠癌首选的治疗手段仍是以手术为主的综合治疗，但存在约35%的患者术后出现肿瘤复发和转移情况，严重影响结肠癌患者的总体治愈率[1]。因此，早日明确结肠癌特异性肿瘤标记物，结合临床个体化治疗，最终达到减少结肠癌患者病死率的目的，是医务工作者目前急需解决的棘手问题。研究[2]发现细胞角蛋白19(CK19)敏感性较高，其可在上皮性肿瘤组织中高表达，而在正常外周血、淋巴结等非上皮组织中低表达。同时，也有研究[3]发现CK19可能参与结肠癌的发生、发展过程，但其具体机制尚未明确。因此，本研究旨在探讨结肠癌术后感染患者外周血中CK19 mRNA转录与蛋白表达的意义，并分析CK19 mRNA转录与蛋白表达情况与患者临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2011年1月至2019年1月我院收治的结肠癌术后感染患者80例作为观察组，另选取同期我院收治的结肠息肉患者80例作为对照组。所有患者均经相关病理学诊断，临床资料完整，患者及家属对本研究内容均知情同意，且所有患者术前均未接受放疗、化疗等；排除合并严重心、肝、肾等器质性疾病的患者，及合并其他内外科疾病和其他肿瘤疾病的患者等。其中观察组男52例，女28例；年龄42～68岁，平均(45.52±2.81)岁；病程0.5～3年，平均(1.42±1.21)年。对照组男54例，女26例；年龄40～67岁，平均(43.68±1.82)岁；病程0.5～3.5年，平均(1.98±1.51)年。两组患者的主要临床一般资料比较无显著性差异(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会审核并通过。

1.2主要试剂及仪器 总RNA提取试剂盒(北京康为世纪公司)、cDNA合成试剂盒(北京康为世纪公司)、实时荧光定量PCR试剂盒(北京康为世纪公司)、普通PCR仪(Bio-Rad公司)、7500实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)等。

1.3方法

1.3.1引物设计 依据CK19的基因序列设计引物、探针，采用Prasgfm Express2.0软件进行引物设计[4]。CK19的上游引物为：5’-ATG TGG TTA CCG TTC CGG GCC-3’，下游引物为：5’-AGC TAT CGG TCC GTC AAG TA-3’，Taqman探针为FAM-5’-AGG TAC CTA CTG CGT CAC GGT CAT TCC AT-3’。

1.3.2总RNA提取 抽取患者外周静脉血5 mL，加入枸橼酸钠抗凝，将其分离为单细胞后收集于离心管中，离心，10 000 r/min，5 min；弃上清，向下层沉淀加入Trizol提取液1 mL，混匀，加200 μL氯仿，混匀，离心，10 000 r/min，15 min；弃沉淀、取上清于离心管中，加异丙醇500 μL，混匀，离心，10 000 r/min，10 min；75%乙醇漂洗，加DEPC水30μL用于溶解RNA，最后在紫外分光光度计下测定RNA的浓度及纯度。

1.3.3逆转录合成cDNA 逆转录的反应体积为20 μL，反应体系为：5×逆转录缓冲液4 μL，2 μL的dNTP(10 mmol/L)，RNasin 1μL(40U)，M-MLV逆转录酶1μL(200U)，OligodT15 1μL(1μg)，样品总RNA 2μg，最后，加DEPC处理过的水至20 μL，混匀后置37℃环境中1 h，并于94℃条件下灭活M-MLV酶。

1.3.4RT-PCR扩增 PCR反应体系:逆转录产物2 μL，10×PCR反应缓冲液3 μL，CK19引物20 mol，Taq DNA酶1U，加DEPC处理过的水至30 μL。反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性40 s，57℃退火40 s，72℃ 90 s，进行35个循环。将PCR产物15 μL上样于含0.5 μg/mL溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶中，电泳，5 V/cm，40 min，最后，于紫外灯下观察并拍摄记录CK19 mRNA表达情况，并分析其与患者临床病理特征的关系。

1.3.5酶联免疫吸附实验(ELISA)检测CK19蛋白的表达水平 采集结肠癌术后感染患者外周静脉血3 mL，离心，3 000 r/min，15 min，取上清，采用ELISA检测CK19蛋白表达水平，并分析外周血CK19蛋白表达量与患者临床病理特征的关系。

1.4观察指标 统计两组CK19 mRNA的阳性表达率；外周血CK19 mRNA阳性表达情况与患者临床病理特征的关系；外周血CK19蛋白表达量与患者临床病理特征的关系。

2 结 果

2.1CK19 mRNA阳性表达率 观察组中CK19 mRNA的阳性表达率为83.75%，对照组中CK19 mRNA的阳性表达率为27.50%，两组比较有显著性差异(P<0.01)。见表1。

表1 两组患者CK19 mRNA阳性表达率比较[n(%)]

2.2外周血CK19 mRNA表达情况与患者临床病理特征的关系 结肠癌术后感染患者外周血CK19 mRNA阳性表达情况与患者的性别和年龄均无明显相关性(P>0.05)；处于C或D分期、低分化和有淋巴结转移患者的外周血CK19 mRNA阳性表达分别显著高于A或B分期、中高分化和无淋巴结转移的患者(P<0.05或P<0.01)。见表2。

表2 外周血CK19 mRNA表达情况与患者临床病理特征的关系[n(%)]

2.3外周血CK19蛋白表达量与患者临床病理特征的关系 结肠癌术后感染患者外周血CK19蛋白表达情况与患者性别和年龄均无明显相关性(P>0.05)；处于C或D分期、低分化和有淋巴结转移的患者外周血CK19蛋白表达水平分别显著高于A或B分期、中高分化和无淋巴结转移的患者(P<0.05或P<0.01)。见表3。

表3 外周血CK19蛋白表达量与患者临床病理特征的关系

3 讨 论

结肠癌发病率和死亡率呈逐年上升的趋势，成为威胁人类生存健康的常见消化道恶性肿瘤。随着医疗卫生条件的改善，结肠癌的治愈率并未得到显著提高，目前仍以手术治疗为主，但大部分患者易发生术后感染，且对于已出现肿瘤转移的患者，预后较差，并且常规的检查手段难以及时发现转移情况[5]。因此，尽快明确结肠癌的早期筛选标志物以及寻找有效的治疗方法显得尤为重要。

CK19是上皮细胞重要的中间纤维，其表达方式的不同反映着上皮细胞分化的不同途径。研究[6]发现，大部分癌细胞分化后仍会保留起源细胞的CKs类型，提示可通过测定CKs的类型进而确定癌细胞的起源，指导拟定针对性的治疗方案。目前，CK19与肿瘤相关的临床参数已成为研究热点。资料[7]显示，CK19表达具有特异性，在正常骨髓、血液、淋巴结中未发现CK19表达，而在结、直肠癌中CK19却呈现高表达，因此，CK19也被认为具有诊断是否发生肿瘤转移的作用。本研究结果显示，观察组患者CK19阳性表达67例，阳性率为83.75%，对照组CK19阳性表达22例，阳性率为27.50%，两组比较有显著性差异，提示CK19 mRNA的阳性表达情况可能与结肠癌发生有一定的相关性。

CK19在判断肿瘤分期、分化程度及微转移情况相关研究中具有至关重要的作用。研究[8]发现，CK19是检测乳腺癌外周血腋窝淋巴结及骨髓等组织中是否存在隐匿转移的可靠标志物。有研究[9]表明，通过检测乳腺癌患者外周血中CK19 mRNA转录与蛋白表达情况可对乳腺癌的早期诊断及预后等进行判断。研究[10]显示，肝癌患者CK19阳性表达的细胞具有增殖能力强、恶性程度高、侵袭力强及预后差等特征。此外，有研究[11-13]报道，在胃癌、肺癌、食管癌等恶性肿瘤的检测中，CK19可作为肿瘤检测的特异标志物。同时，也有研究[14]发现，根据结肠癌患者外周血CK19 mRNA转录与蛋白表达水平有助于监测结肠癌微转移情况。本研究结果显示，结肠癌术后感染患者外周血CK19 mRNA转录与蛋白表达水平与患者的性别和年龄均无明显相关性，而与患者Dukes分期、分化程度及淋巴结转移情况有关，且与处于A或B分期、中高分化和无淋巴结转移患者相比，处于C或D分期、低分化和有淋巴结转移患者的外周血CK19 mRNA阳性表达和蛋白表达水平均显著升高，提示检测外周血中CK19 mRNA转录与蛋白表达水平，可推断患者外周血中是否有肿瘤细胞，判断是否存在肿瘤微转移，进而可指导结肠癌的早期干预，制定个体化的治疗措施，尤其对已发生肿瘤转移的患者，可以指导其临床诊断和治疗。

综上，结肠癌术后感染患者CK19 mRNA阳性表达率较高，且CK19 mRNA转录及蛋白表达水平与肿瘤的分期、分化程度及淋巴结转移情况具有明显相关性，这在结肠癌病变的早期诊断中具有指导性意义。