HPLC测定黄芩不同部位、不同炮制品中4种黄酮类成分的含量

张文新，杨翠玲

（山西卫生健康职业学院，山西 太原 030006）

黄芩为唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensisGeorgi）的干燥根，有效成分主要为黄酮类化合物，主要包括黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素4种成分[1]。这4种成分虽然均属黄酮类成分，但其药理活性并不完全一致，如黄芩苷和黄芩素均具有解热、保肝、利胆、抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗抑郁、抗氧化等药理作用[2]，黄芩苷还有安胎、抗抑郁、抗癫痫等作用[3]，汉黄芩苷具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗氧化、心血管保护、神经保护等多种药理活性[4]，汉黄芩素具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗肿瘤增殖、治疗急性肾损伤等作用[5]。2020年版《中国药典》以黄芩苷含量作为评价黄芩质量的指标，评价指标单一，不能综合反映黄芩中有效成分的含量。因此，应建立更全面的多指标方法评价黄芩药材的质量。

已有文献报道了黄芩中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的含量测定方法，但方法各有欠缺，高效液相色谱（HPLC）法[6-7]存在分析时间较长或流动相的配制较复杂[8]等缺点，超高效液相色谱（UPLC）法[9-10]虽然分析时间短，但仪器价格昂贵，应用不普遍，方法的推广有一定的局限性。本研究建立了HPLC法测定黄芩中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量，并研究了黄芩药材不同部位、不同炮制品中4种成分含量的差异，为黄芩的质量标准提升、提取加工及临床应用提供一定的参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260 Infinity II型高效液相色谱仪（美国Agilent公司，配置四元梯度泵、柱温箱、自动进样器、二极管阵列检测器）；AS3120型超声清洗仪（德国Autoscience公司）；XPE 105型十万分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司）；BSA224S型万分之一天平（德国Sartorius公司）。

1.2 试药

黄芩苷对照品（成都克洛玛生物科技有限公司，纯度：≥98 %，批号：CHB190115）；黄芩素对照品（成都克洛玛生物科技有限公司，纯度：≥98 %，批号：CHB190116）；汉黄芩苷对照品（成都克洛玛生物科技有限公司，纯度：≥98 %，批号：CHB190115）；汉黄芩素对照品（成都克洛玛生物科技有限公司，纯度：HPLC≥98 %，批号：CHB190116）；黄芩药材采集于山西运城，经山西卫生健康职业学院杨翠玲副教授鉴定为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensisGeorgi的根；黄芩生药为将采集的黄芩根部轻轻刷去表面的泥沙，室温放至干燥；生黄芩为取黄芩生药，洗净，蒸20 min，取出，切薄片，置烘箱中，60 ℃烘30 min；酒黄芩为取生黄芩片，加10 %黄酒拌匀，闷透，用文火炒至深黄色，取出放凉；乙腈（色谱纯，梯度级，HiPure Chem公司，批号：16200801）；甲酸（色谱纯，Honeywell Fluka，批号：H1250）；甲醇（色谱纯，天津大茂化学试剂厂）；乙醇（分析纯，天津市北辰方正试剂厂）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 黄芩中4种黄酮类成分的含量测定

2.1.1 色谱条件 Waters XSelect HSS C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：0.1 %甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～10 min，25 %～30 %B；10～30 min，30 %～50 %B；30～35 min，50 %～100 %B）；流速：1.0 ml/min；检测波长：275 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μl。

2.1.2 混合对照品溶液的制备 分别精密称取黄芩苷，汉黄芩苷，黄芩素和汉黄芩素26.34，15.53，5.29，2.16 mg，分别置于25 ml量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀；分别精密量取上述对照品溶液12.5，5，1.25，0.5 ml，置同一25 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备 取已干燥的黄芩样品中粉约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70 %乙醇100 ml，称定重量，超声（120 W，40 kHz）提取30 min，冷却至室温，称定，用70 %乙醇补足减失的重量，摇匀，上清经0.45 μm有机滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 专属性试验 分别精密吸取混合对照品溶液和黄芩供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1。供试品溶液色谱图中，在与对照品溶液色谱图相应的位置上，黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素均有相同保留时间的色谱峰，且供试品中4种成分与其他组分均能完全分离，无干扰。

图1 黄芩4种黄酮成分的HPLC图谱

2.1.5 线性关系考察 分别精密量取混合对照品溶液2，4，6，8，10 ml，置于5个10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜过滤，备用；分别精密吸取上述不同浓度的溶液各10 μl，按2.1.1项下色谱条件进样测定。以对应组分峰面积积分值（Y）对其质量浓度（X，μg/ml） 进行线性回归，结果见表1。可知各组分在其对应的浓度范围内线性关系良好。

表1 各组分的线性关系

2.1.6 精密度试验 精密吸取同一混合对照品溶液10 μl，连续进样6次，测定，计算各成分峰面积的RSD值，结果分别为黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素峰面积的RSD分别为0.97 %，1.00 %，0.90 %，0.98 %，表明仪器精密度良好。

2.1.7 重复性试验 取同一批黄芩样品6份，各0.2 g，精密称定，分别按2.1.3项下方法制备供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件进行分析测定，测得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的平均含量分别为16.74 %，3.58 %，0.12 %，0.04 %，RSD分别为1.16 %，1.34 %，1.83 %，1.63 %（n=6）。结果表明，该方法的重复性良好。

2.1.8 稳定性试验 取新制备的同一供试品溶液，分别于配制后在室温下放置0，2.5，5，7.5，12，24 h，按2.1.1项下色谱条件进样测定，计算各组分峰面积的RSD值，结果黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素峰面积RSD分别为0.30 %，0.31 %，1.32 %，0.65 %，表明供试品溶液在室温下24 h内稳定性良好。

2.1.9 加样回收试验 取已知含量的样品6份，分别精密加入一定量黄芩苷，汉黄芩苷，黄芩素，汉黄芩素的对照品，按2.1.3项下方法制成供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件测定，计算平均回收率和RSD值，结果见表2。由表2可见，各被测组分的加样回收率良好。

表2 加样回收试验结果

2.2 黄芩不同部位、不同炮制品中4种黄酮成分的含量

2.2.1 黄芩不同部位中4种黄酮成分的含量 取黄芩生药，轻轻刷去表面的泥沙，然后分离出黄芩的栓皮、韧皮部和木质部，干燥，分别打成中粉，按2.1.3项下方法制备供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件测定峰面积，并用外标法计算样品中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量，结果见表3。结果显示，黄芩木质部中仅含黄芩苷和汉黄芩苷，几乎不含黄芩素和汉黄芩素；韧皮部含4种黄酮成分；栓皮中黄芩素和汉黄芩素含量较高，且含少量黄芩苷和汉黄芩苷。

表3 黄芩药材不同组织部位中4种成分的含量（n=3）

因此，黄芩中的黄芩苷和汉黄芩苷主要来源于木质部和韧皮部，对应的苷元黄芩素和汉黄芩素主要来源于韧皮部和栓皮。枯芩由于木质部中空，黄芩苷含量降低，黄芩素的含量较高；子芩为新根，中部坚实，黄芩苷含量高。黄芩苷和黄芩素都有清热、抗菌、抗病毒功效，不同的是黄芩素吸收较快，生物利用度优于黄芩苷，而黄芩苷需经肠内微生物水解，产生其苷元后才被吸收[7]。这也就解释了传统中医认为的枯芩善清肺热，主治热痰咳喘；子芩善清胃肠火邪，主治胃肠湿热泻痢及血痢。

2.2.2 不同加工方法对4种黄酮成分含量的影响 按《中国药典》2020年版一部黄芩的加工方法，考察生药的干燥方式、生黄芩的杀酶软化方式、酒黄芩10 %黄酒浸润后的干燥方式对4种成分的影响，见表4。结果显示，黄芩生药中4种成分总含量最高，洗、蒸、煮、烘、炒的加工方式都会引起含量的降低，生黄芩的煮制软化方式易引起黄酮成分的流失，原因可能是煮制会使药材与水大面积接触，使有效成分溶于水中或煮的时间短，不能使酶完全灭活，引起苷类的降解，从而降低药材中黄酮的含量。酒黄芩经酒浸润后，采用了烘干与炒干两种方式干燥，发现炒干的4种成分的含量均高于烘干，酒黄芩与生黄芩相比，虽然苷类成分含量降低，但苷元含量增加。

表4 黄芩不同加工方法对4种黄酮成分含量的影响（n=3）

2.2.3 支根与主根中4种黄酮类成分含量的差异 同一批生黄芩，分出主根与支根，考察主根与支根中4种成分含量差异，见表5。结果表明，4种成分在黄芩支根和主根中的含量基本相同。

表5 黄芩支根与主根中4种成分的含量（n=3）

3 讨论

3.1 超声提取条件的选择

3.1.1 提取溶剂的选择 前期通过单因素实验考察了甲醇和70 %乙醇对4种成分提取率的影响，发现同等条件下，70 %乙醇对4种成分的提取率，尤其是苷类成分黄芩苷和汉黄芩苷的提取率都高于甲醇，故选择70 %乙醇作为超声提取的溶剂。

3.1.2 超声时间的选择 通过查阅文献[11-12]，考察了超声提取15，30，45 min对4种成分提出率的影响，结果发现超声不同时间，4种成分的溶出率没有明显差异，超声30 min时4种成分的含量略高于超声15 min，为保证所有成分能全部溶出，本课题采用30 min作为超声提取的时间。

3.2 检测条件的选择

3.2.1 检测波长的选择 采用二极管阵列检测器，分别对4个成分的对照品溶液在200～400 nm进行全波长扫描，4种成分在275 nm处都有最大吸收，因此选择275 nm作为检测波长。

3.2.2 柱温、流动相及进样量的选择 其他条件不变的情况下，进样量、柱温及流动相都会影响分离效果。其他条件不变的情况下，进样量主要影响黄芩苷的分离效果：进样量为20 μl时，黄芩苷的色谱峰有明显拖尾，与其他组分不能分离，进样量≤10 μl时，黄芩苷色谱峰对称、分离度高；检测温度为25 ℃时，汉黄芩苷与其他组分不能完全分离；将流动相的乙腈换为甲醇时，黄芩苷和汉黄芩苷不能完全分离。

3.3 本文建立检测方法的优点

本文建立方法分析时间短，操作简单，同时测定4个指标成分来评价黄芩的质量。另外，本文首次研究了黄芩中4种黄酮类（黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素）在木质部、韧皮部和栓皮中含量的不同，发现黄芩苷和汉黄芩苷主要存在于韧皮部和木质部，栓皮中含量较少；栓皮中黄芩素和汉黄芩素含量最高，其次为韧皮部，木质部则几乎不含黄芩素和汉黄芩素。因此，在黄芩含量测定中，样品打粉要完全，粉末混合要均匀，否则黄芩素和汉黄芩素的含量测定误差较大。