黄芩超临界微乳剂抗菌及促畜禽生长性能研究

高腾美，常娟，杨涵月，常银霞 ，魏砚明，张越

（1.山西中医药大学中药与食品工程学院，山西太原 030619；2.山西大学化学化工学院，山西太原 030006）

黄芩是一种已被证实具有良好抗菌作用的中药材，其提取物黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素具有抑菌、抗病毒、增强畜禽免疫力的作用（姜希红等，2020；崔巍，2020；辛文妤等，2013；李景松等，2013；李国忠等，2012）。研究表明，黄芩素和汉黄芩素是黄芩中真正起药效作用的物质，但其需要经肠道菌群水解成苷元黄芩素和汉黄芩素才可以发挥作用（陈丽艳等，2011；Yim等，2004；车庆明等，2001）。然而，黄芩素和汉黄芩素为疏水性强的脂溶性化合物（白荣等，2020），多元醇、水等常见药用溶剂无法有效溶解黄芩素和汉黄芩素，进而无法达到良好的抑菌效果，更无法添加到畜禽饮用水中促进畜禽健康生长。而且直接使用黄芩素和汉黄芩素又易氧化失活，进而影响其药效。

微乳作为一种新型药物载体具有分散性高、增溶效果好和生物黏附性强等优点（王春龙等，2008）。口服后可经淋巴管吸收，从而克服首过效应及大分子通过胃肠道上皮细胞膜时的障碍（张正全等，2001），并能提高药物的生物利用度，影响药物的代谢和分布，延长药物的体内循环时间及提高组织靶向性（柯学等，2010；王春龙等，2008）。

黄芩超临界提取物主要以黄芩素、汉黄芩素为主，还含有少量的黄芩黄酮II 和千层纸素A。本文采用聚氧乙烯蓖麻油做油相，非离子表面活性剂做乳化剂，短链脂肪醇为助乳化剂将黄芩超临界提取物制成微乳剂，考察黄芩超临界提取物微乳剂的体外抑菌性能，以及对畜禽生长性能的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备 7071 超临界CO2萃取装置（美国ASI公司）；HL-5L+1L超临界CO2萃取装置（广州浩立生物科技有限公司）；e2695 高效液相色谱仪，配备2998 PDA 检测器（美国Waters 公司）；pH-0770A 培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；16100S-212 立式压力蒸汽灭菌锅（上海博讯医疗生物仪器股份有限公司）；Cary50 型-紫外分光光度计（美国Varian 公司）。

1.2 药物与试剂 黄芩药材购自山西元和堂中药有限公司（产地：山西，批号：200201），经山西中医药大学中药学院中药与食品工程学院药用植物教研室鉴定为唇形科植物黄芩的干燥根；黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素、千层纸素A、黄芩黄酮II 对照品均购自上海源叶生物科技有限公司；聚氧乙烯蓖麻油、司盘80、吐温20 购自北京百奥莱博科技有限公司；琼脂粉、蛋白胨、牛肉膏购自北京博星生物科技有限公司；供试菌株：大肠杆菌标准菌株CMCC（B）44102、金黄色葡萄球菌标准菌株CMCC（B）26003 购自上海鲁微科技有限公司；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。

1.3 黄芩超临界CO2提取及含量测定 通过单因素试验，对黄芩超临界萃取温度、萃取压力、黄芩粒径、夹带剂乙醇的量等工艺参数进行了优化。通过高效液相色谱测得其各成分百分含量，色谱条件参考申洁等（2019）方法做了适当修改：Thermo BDSHYPERSIL C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.1%甲酸水（A）-甲醇（B）-乙腈（C），以0.1%甲酸水-甲醇-乙腈为流动相进行梯度洗脱，0 min（80/15/5，V/V/V）、8 min（60/34/6，V/V/V）、25 min（37.5/55/7.5，V/V/V）、35 min（26/66/8，V/V/V）、45 min（10/80/10，V/V/V）。柱温：30 ℃；DAD 检测波长：278 nm；流速1 mL/min；进样量：20 μL。

1.4 黄芩超临界微乳剂的制备及稳定性考察 为了增加药物的溶解性，提高生物利用度。基于国内外药典及相关安全性数据，进行配方组分的选择。通过对超临界提取物溶解性评价，筛选出聚氧乙烯氢化蓖麻油为油相，选用司盘80、吐温20 非离子表面活性剂为主表面活性剂，异丙醇为助表面活性剂。通过对各组分进行相图研究，确定两相区及微乳液区域，在此基础上对配方进行优选。并用动态光散射测定了油包水和水包油两种微乳剂的粒径。将制备的黄芩自微乳制剂于5、20 ℃恒温箱、-20℃冰箱中冷藏条件下避光贮存8周，观察其外观。

1.5 微乳剂体外抑菌试验 选取畜禽易感的大肠杆菌革兰氏阴性菌和金黄色葡萄球菌革兰氏阳性菌为研究对象，采用滤纸片法和倍比稀释法测定黄芩不同成分抑菌圈直径和最小抑菌浓度（MIC），分析黄芩成分抑菌活性，并测定黄芩超临界微乳剂和水提物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长曲线。

1.5.1 培养基的制备 固体培养基制备（郝林等，2016）：准确称取蛋白胨1.0 g，牛肉膏0.5 g，氯化钠0.5 g，加水加热溶解，再加入琼脂粉1.5 g，继续搅拌加热至完全融化，补足蒸馏水至100 mL，以10%NaOH 溶液调节pH 至7.2～7.4，趁热过滤，分装于三角瓶内，121 ℃高压蒸汽锅中灭菌20 min，备用。液体培养基：除不加琼脂粉，其他制作方法同固体培养基。

1.5.2 菌悬液的制备 将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别用固体培养基进行菌种斜面活化，在37 ℃培养箱中培养24 h，分别将每个菌种挑取菌苔置液体培养基，在37 ℃培养箱中培养24 h，控制菌液浓度达到105～ 106cfu/mL 后待用。

1.5.3 黄芩提取液抑菌效率 本试验对黄芩不同提取物抑菌活性的研究采用滤纸片和抑菌圈法，供试细菌菌悬液浓度为105～ 106cfu/mL。药敏滤纸片的制备：将直径为6 mm 的灭菌滤纸片分别浸于黄芩超临界微乳剂（含药1.4%）、黄芩水提物（含药1.4%）、空白微乳剂和生理盐水中，静置30 min 取出晾干备用。将灭菌的固体培养基倒入培养皿内，在无菌条件下吸取供试菌液体0.1 mL滴在固体培养基表面，涂布均匀，将药敏滤纸片贴于培养基表面，于培养箱中37 ℃恒温培养24 h。测定抑菌圈直径，每个平皿重复3次，无菌生理盐水和空白微乳剂为阴性对照。

1.5.4 黄芩提取物及几种单体最低抑菌浓度的测定 为进一步对黄芩提取物及各单体的抑菌活性、抑菌能力和抑菌机理进行研究。采用微量稀释法对黄芩提取物和黄芩6 种单体的最小抑菌浓度（MIC）进行测定。取黄芩水提物、黄芩超临界微乳剂（含药量）、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素、千层纸素A、黄芩黄酮II 标准品各3.0 mg，对不溶于水的成分滴入少量DMSO 溶解，随后加入营养肉汤培养基配制成浓度为3.0 mg/mL 的溶液，备用。参照Peng 等（2011）方法，以96 孔板测定其最小抑菌浓度。首先向96 孔板3～11 列每孔加入100 μL 营养肉汤培养基，向第1、2 列分别对应加入上述所配制的溶液200 μL，从第2 列吸去100 μL 至第3 列如此连续倍比稀释至第10列，取100 μL 弃去，使各孔浓度依次为原液浓度的1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256。向2～11 列分别加入大肠杆菌菌液100 μL。另取96孔板加入血清肉汤培养基以及金黄色葡萄球菌，方法同上。摇匀37 ℃培养24 h，取出观察细菌生长情况，以肉眼观察无细菌生长为最低浓度。

1.5.5 生长曲线的测定 为进一步探讨抑菌机制，研究两种提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长的影响。参考郭丽丽等（2019）的方法进行测定，具体简述如下：配制与菌种相对应的液体培养基，分别取100 mL 装入3 个250 mL 锥形瓶中，并标记为1、2、3号，121 ℃高压灭菌20 min，冷却后接种入1 mL 适宜浓度（105～ 106cfu/mL）的菌悬液。向1、2 号锥形瓶中分别加入等体积的适量提取物原液和2 倍稀释液，使其终浓度达到1×MIC 和1/2×MIC，以加有等体积生理盐水的3 号液体培养基为对照。将锥形瓶置于37 ℃、150 r/min摇床培养24 h，期间每隔2 h 在无菌条件下取样，在600 nm 波长处测定并记录吸光度OD值，重复3次，然后以时间为横坐标，OD 平均值为纵坐标绘制供试菌的生长曲线。

1.6 鸡的生长性能试验 为评价黄芩超临界微乳剂对畜禽的抗菌和生长促进作用，以白羽肉鸡作为试验对象，考察在肉鸡饲喂水中添加黄芩微乳剂对其生长性能的影响。

试验动物：每个剂量组选择1 日龄健康、体重接近的白羽肉鸡50羽，随机分成5组，每组10 个重复。试验期为42 d，常规饲养，21 日龄换料。基础日粮为专门订制的不含抗生素的肉鸡饲料，具体黄芩添加量、添加剂型和肉仔鸡日增重和料肉比见表2。

1.7 统计学分析 用SPSS19.0 统计软件进行单因素方差分析，Ducan’s 法对各重复指标进行多重比较，数据以“平均值±标准误”表示，P <0.05表示差异显著，P >0.05 表示差异不显著。

2 结果

2.1 黄芩超临界CO2提取工艺及含量测定 黄芩超临界CO2最佳提取条件为：萃取温度45 ℃、萃取压力25 Mpa、黄芩目数40 目、夹带剂95%乙醇的量为每克黄芩0.75 mL。将夹带剂和黄芩提前拌匀放置过夜，可以大大缩短提取时间。对于1 L 萃取釜1 h 即可萃取完，收集萃取液减压浓缩、冷冻干燥得黄芩超临界CO2提取物，100 g 黄芩可得0.677 g超临界萃取物。萃取物中以黄芩苷元为主，主要有黄芩素和汉黄芩素，还有少量的黄芩黄酮II 和千层纸素A，通过高效液相色谱测得其各成分百分含量依次为42.1%、36.5%、2.9%、8.4%，色谱图见图1。

图1 黄芩超临界液相色谱图

2.2 黄芩超临界微乳剂的制备及稳定性考察图2 为黄芩超临界微乳剂配方的拟三元相图，左下角为表面活性剂和油相的混合物（表面活性剂与油相比例为3：10 质量比）；右下角为水；顶角为助表面活性剂（异丙醇）。典型的配方如图2 左下角所示，经过虚线（加水稀释），可以逐渐由油包水向水包油微乳液转变，最终达到右下角的状态，两种状态溶液均呈半透明均相液体，无可见的悬浮物和沉淀。药品成品为油包水微乳液，在使用稀释过程仍保持微乳液状态，但转变为水包油。一方面是用起来方便，另一方面进入动物体内也可以让药物以纳米级液滴分散，提高药效。

图2 黄芩超临界微乳剂拟三元相图

用动态光散射测定油包水和水包油两种微乳剂的粒径，结果显示都是在60 nm 粒径以下的微乳液状态，完全符合微乳剂10～100 nm 的要求。将制备的黄芩自微乳制剂于5、20 ℃条件下避光储存8周后，其外观仍保持均相透明，无药物析出或分层现象，药物含量及粒径也无明显变化。说明微乳剂热稳定性高。将制备的黄芩自微乳制剂于-20 ℃条件下储存8 周后，其外观仍保持均相透明，无药物析出或分层现象，药物含量及粒径也无明显变化。说明微乳剂耐寒稳定性高。随后的试验中采用在35 g 聚氧乙烯蓖麻油中加入10 g 司盘80，5 g 吐温20，搅拌混合均匀，再加入34 g 异丙醇，搅拌混合均匀，加入3.5 g 黄芩CO2超临界提取物，搅拌混合至外观澄清透明，制备得到黄芩超临界微乳剂。

2.3 黄芩提取液抑菌性分析 由表1 可以看出，与阴性对照相比，黄芩超临界微乳剂和黄芩水提物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌作用。黄芩超临界微乳剂对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用强于黄芩水提物，黄芩超临界微乳剂和黄芩水提物对金黄色葡萄球菌的抑菌作用强于大肠杆菌。

表1 黄芩提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈 mm

2.4 黄芩提取物及几种单体最低抑菌浓度的测定试验结果显示，黄芩水提物对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为3 mg/mL，对大肠杆菌最低抑菌浓度为20.5 mg/mL；黄芩超临界微乳剂对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度为0.187、0.093 mg/mL。黄芩中各成分的抑菌效果大小依次为黄芩素＞汉黄芩素、黄芩黄酮II＞黄芩苷＞汉黄芩苷和千层纸素A。因此，黄芩超临界微乳剂对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用和抑菌效果明显强于黄芩水提物。对大肠杆菌的最低抑菌浓度仅为传统黄芩水提取物（主要成分黄芩苷54.7%和汉黄芩苷15.6%）浓度的1/110；对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度仅为传统黄芩水提取物浓度的1/32。

2.5 生长曲线的测定 从生长曲线图3、图4 可以看出，对照组金黄色葡萄球菌正常生长，有明显的迟缓期、对数期、稳定期。金黄色葡萄球菌经浓度为0.093 mg/mL 的黄芩超临界微乳剂和3.0 mg/mL 的黄芩水提物作用后，生长均受到明显抑制，600 nm 处的吸光度值在整个培养时间内几乎无明显变化，菌体停止生长，说明黄芩超临界微乳剂、黄芩水提物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果显著。当黄芩超临界微乳剂、黄芩水提物的浓度减少为1/2 MIC 值时，可以看出此条件下菌体仅有少量繁殖，且生长速率和浓度明显低于对照组，说明菌体的部分生长活性受到了抑制。微乳剂和黄芩水提物对大肠杆菌生长的影响，也有类似金黄色葡萄球菌的结果。

图3 黄芩超临界微乳剂对金黄色葡萄球菌生长曲线影响

图4 黄芩水提物对金黄色葡萄球菌生长曲线影响

2.6 鸡生长性能的测定 由表2 可知，空白组（即只喂基础日粮）和阳性对照组（即抗生素组盐酸林可霉素）相比料肉比基本相当；C 组黄芩超临界微乳剂饮水式与A 组黄芩原粉拌基础日粮和B组黄芩水提物饮水式相比，C 组黄芩超临界微乳剂饮水式料肉比最低。试验各组1 日龄鸡体重相近，与对照组相比无显著性差异（P >0.05）；试验各组21 日龄鸡体重较对照组均有不同程度的提高，其中黄芩超临界微乳剂饮水C1组、黄芩原粉A1组和黄芩水提饮水B2组较对照组分别提高了13.21%、5.87%和4.91%（P <0.05）；试验各组1～ 21 日龄料肉比较对照组都有所降低，试验C1组和试验A1组较对照组分别降低了9.70%和7.27%，差异显著（P <0.05），试验B2组较对照组有所降低，但差异不显著（P >0.05）；除A3组和B3组试验各组42 日龄鸡体重较对照组均有不同程度提高，试验C1组、试验A1组和试验B2组较对照组分别提高了19.51%、6.06%、0.56%（P <0.05）；试验大多数组22～ 42 日龄料肉比较对照组有降低的趋势，试验C1组和试验A1组较对照组分别降低了16.75%、7.11%（P <0.05），试验B2组较阳性对照组有所降低，但差异不显著（P >0.05）。从鸡的生长性能看黄芩超临界微乳剂饮水组效果最好，鸡的饮水中添加0.01%的黄芩超临界微乳剂即可获得很好的生长性能，说明微乳剂型使药物呈纳米级分散有利于鸡的消化吸收，可以促进鸡的生长发育。黄芩水提物的生物利用度较低，且与相同浓度的自微乳剂相比，差异性显著，也说明黄芩苷元相比黄芩苷的生物利用度更高。

表2 黄芩不同剂型对肉仔鸡日增重和料肉比的影响

3 结论

本试验结果表明，微乳剂对大肠杆菌的最低抑菌浓度仅为传统黄芩水提取物浓度的1/110，而对金黄葡萄球菌的最低抑菌浓度仅为传统黄芩水提取物浓度的1/32。42 日龄肉仔鸡生长试验评价表明，在肉鸡饲喂水中添加0.01%黄芩超临界微乳剂，可以提高肉仔鸡的增重和饲料转化率，降低料肉比，提高养鸡的经济效益。在饲养过程中未出现白羽鸡的死亡，表明该黄芩微乳剂兼具药用和营养功效，既能预防畜禽疾病又能促进生长，作为替代抗生素的后备中草药具有良好的应用前景。