内源性apelin对大鼠丘脑底核神经元兴奋性影响

康楠伟,薛雁,刘翠,陈蕾

(青岛大学医学部基础医学院生理学与病理生理学系,山东 青岛 266071)

Apelin是由长度为77个氨基酸的前体肽被血管紧张素酶2切割成的不同亚型的生物活性肽，根据其C末端氨基酸数量可分为apelin-13、apelin-17和apelin-36等[1-2]。apelin受体属于7次跨膜的G蛋白偶联受体家族[3]。apelin及其受体系统广泛分布于中枢神经系统[3-4]。有文献报道，apelin与机体运动调控密切相关[5-6]。丘脑底核是基底神经核间接通路和超直接通路中的关键核团，在躯体运动调控中发挥重要功能[7]。丘脑底核深部脑刺激可以增强与运动和认知网络相关的振荡活动，降低丘脑底核神经元的兴奋性，改善运动和认知能力[8]。形态学研究结果证实，丘脑底核表达apelin及其受体，然而内源性apelin对丘脑底核神经元放电频率的影响目前尚不清楚。为此，本实验用apelin受体阻断剂ML221阻断丘脑底核内源性apelin，利用在体电生理记录方法观察内源性apelin是否参与调控丘脑底核神经元自发放电活动。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物 成年雄性Wistar大鼠，体质量250～300 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。大鼠每笼5只饲养在(22±1)℃的温控室内，给予人工光照(12 h光暗循环)，正常标准饮食，自由饮水。在开始实验前适应环境1周。所有动物实验操作均遵循医学伦理学原则。

1.1.2实验药品 ML221购于美国MedChemExpress公司，乌拉坦购于上海麦克林生化科技有限公司，滂胺天蓝和乙酸钠溶液购于美国Sigma公司。

1.2 实验方法

腹腔注射乌拉坦1 g/kg麻醉大鼠，将大鼠放置在立体定向框架中，水平固定头部，切牙杆位于双耳线下方3.3 mm处。定位丘脑底核(前囟后3.1～4.2 mm，旁开2.0～3.0 mm，颅骨外表面下7.2～9.0 mm)并进行开颅手术。三管玻璃微电极的记录电极管内注入含有20 g/L滂胺天蓝的0.5 mol/L乙酸钠溶液，其余两管则分别注入无菌生理盐水和10 μmol/L的ML221[9]。使用液压推进器将玻璃微电极尖端推至丘脑底核，记录到神经元放电并稳定5 min后，通过生物细胞纳升精密注射器将生理盐水或ML221注射到记录的细胞表面。放大器和数模转换器将生物信号转化为数字信号后传输至计算机，用Spike 2软件进行记录和分析。

以加药前120 s的平均放电频率为基础放电频率，加药后反应高峰处50 s的平均放电频率为药物反应频率。如果药物反应频率大于基础放电频率均数+2倍标准差或小于基础放电频率均数-2倍标准差，则认为神经元对药物有反应，否则认为神经元对药物无反应。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 丘脑底核微量注射ML221对大鼠神经元放电频率的影响

在记录到的6个丘脑底核神经元中，微压力注射生理盐水后，其放电频率由(7.44±2.39)Hz变为(7.56±2.49)Hz(t=-0.346，P>0.05)，放电频率变化百分数为(4.15±4.77)%。另外记录到的18个丘脑底核神经元，其基础放电频率为(5.39±0.94)Hz。微压力注射10 μmol/L的ML221可使其中8个神经元的自发放电频率由(7.44±1.41)Hz降低至(1.81±0.32)Hz(t=4.263，P<0.01)；其放电频率降低百分数为(72.34±6.10)%，与生理盐水对照组比较差异有统计学意义(Z=-3.098，P<0.01)。在另外5个神经元中，ML221使细胞自发放电频率由(2.80±0.90)Hz升高至(5.06±2.12)Hz(t=-1.697，P>0.05)，虽然差异无显著意义，但单独分析这5个细胞，其加药后放电频率均大于基础放电频率均数+2倍标准差，故认为ML221增加其放电频率；这5个神经元放电频率增加的百分数为(64.85±19.86)%，与生理盐水对照组比较差异有显著性(Z=2.739，P<0.01)。在剩余的5个丘脑底核神经元中，注射ML221后，其自发放电频率由(3.08±1.51)Hz变为(3.24±1.56)Hz(t=-2.390，P>0.05)，加药后放电频率均小于基础放电频率均数+2倍标准差且大于基础放电频率均数-2倍标准差，放电频率变化的百分数为(8.82±4.38)%。见图1。

2.2 ML221对丘脑底核神经元自发放电频率调控与基础放电频率及神经元放电模式的关系

上述ML221引起放电频率降低的8个丘脑底核神经元的自发放电频率为(7.44±1.41)Hz，而ML221引起放电频率增加的5个丘脑底核神经元的自发放电频率为(2.80±0.90)Hz，两组神经元自发放电频率比较差异有统计学意义(t=2.392，P<0.05)。ML221引起的放电频率降低(r=-0.409，P>0.05)和增加(r=0.620，P>0.05)与基础放电频率没有相关性。

根据放电间隔直方图和自相关图分析，丘脑底核神经元分为规则放电、不规则放电和簇状放电3种放电模式。在ML221引起放电频率降低的8个神经元中，这3种放电模式所占比例分别为12.5%、25.0%和62.5%；而在ML221引起放电频率增加的5个丘脑底核神经元中，这3种放电模式所占比例分别为20.0%、20.0%和60.0%。

A、B：典型频率直方图显示ML221使不同丘脑底核神经元的放电频率降低(A)或增加(B)；C：柱状图显示ML221和生理盐水对丘脑底核神经元放电频率的影响。**P<0.01。

3 讨 论

基底神经核是包括纹状体、苍白球、黑质及丘脑底核等核团在内的皮质下一系列核团的总称，其中纹状体是其输入结构，苍白球内侧部和黑质网状带是其输出结构。输入、输出结构之间核团的信息交流构成两大经典环路，即直接通路和间接通路[10]。此外，丘脑底核也可直接接受来自兴奋性皮质和丘脑的纤维投射(即超直接通路)[11]。直接通路提高大脑皮质的兴奋性，而间接通路和超直接通路则具有相反的作用，三条通路相互协调、相互制约以保证运动的平衡性[12]。

丘脑底核是基底神经核最主要的核团之一，也是唯一的兴奋性核团，其神经元电活动变化在调节皮质神经元兴奋性方面具有重要作用[12]。ARON等[13]于2007年利用功能性磁共振成像技术发现，当运动计划被终止时，丘脑底核显著激活。因此，丘脑底核也被认为是运动控制系统中起“制动”作用的主要核团之一。由此推测，丘脑底核神经元基础放电频率的改变，可能通过基底神经核内的直接通路、间接通路或超直接通路来调控皮质运动区神经元兴奋性，最终参与运动的调控。

Apelin及其受体系统在大脑、心脏、胃、脂肪组织和血管内皮细胞等器官组织中均有表达，具有广泛而重要的生理功能。KASAI等[5]发现，apelin缺乏加速肌萎缩侧索硬化症的病理进展。apelin-13能抑制促炎细胞因子的分泌，促进脊髓损伤动物的感觉功能恢复，并增加其运动行为[6]。本研究观察到，丘脑底核微量注射apelin受体阻断剂ML221可改变神经元的自发放电频率，提示丘脑底核内源性apelin参与调控神经元兴奋性。以往也有研究观察到内源性apelin发挥重要功能。例如，鞘内单次注射apelin受体拮抗剂ML221，可暂时减少慢性压榨损伤引起的疼痛过敏[9]；急性应激可引起下丘脑室旁核内apelin受体mRNA的水平升高，而慢性反复应激则可诱导apelin受体表达的持久上调[14]。

本研究观察到，丘脑底核内源性apelin对神经元自发放电具有双向效应。丘脑底核给予ML221可以引起大部分神经元放电频率降低，提示内源性apelin增加神经元的兴奋性；而在少部分神经元，ML221可增加其放电频率，提示内源性apelin抑制其兴奋性。之前也有关于apelin双向效应的相关报道。DAI等[15]运用膜片钳技术研究发现，apelin-13对穹隆下器神经元具有除极化和超极化的双向效应，这些效应似乎分别是由非选择性阳离子通道和钾通道的激活而引发。本研究结果表明，ML221产生抑制和兴奋效应的两组神经元的基础放电频率存在差异，推测可能与丘脑底核神经元的种类不同有关。近期的形态学研究揭示丘脑底核确实存在有轴突侧支和无轴突侧支两种不同类型神经元[16]。虽然该文献同时报道了这两类不同形态神经元的膜电阻、膜电容、动作电位幅度和兴奋阈值等电生理特性无显著差异，但是并没有报道这两类神经元的自发放电频率是否存在差异。因此，就目前的研究尚不能确定丘脑底核是否存在具有不同自发放电频率的神经元亚群。但之前有文献报道，与丘脑底核有紧密形态和功能联系的苍白球，其两类神经元(小清蛋白阳性神经元和PAS结构域蛋白1阳性神经元)的自发放电频率有差异[17]。本实验室最近的电生理实验研究结果显示，apelin-13对苍白球神经元的自发放电频率调控亦具有兴奋和抑制的双向效应[18]。由上述研究可见，ML221对丘脑底核神经元兴奋性的双向效应可能因为不同类型神经元介导的信号通路和离子通道机制不同。既往研究表明，在不同的细胞apelin可以激活不同的信号通路而发挥不同的作用。例如，激活apelin受体/缓激肽1受体异源二聚体促进内皮型一氧化氮合酶磷酸化并导致Gαq介导的PKC信号通路活性显著增加[19]。而在转染apelin受体的中国仓鼠卵巢细胞中，apelin抑制forskolin诱导的环磷酸腺苷产生，提示apelin受体与Gαi有功能性联系[20]。apelin在表达apelin受体的293T细胞中诱导Akt/PKB的磷酸化，但在没有表达apelin受体的293T细胞中则没有该效应[21]。此外，还有研究观察到apelin对血压也可以发挥双向调节作用。apelin-13与其受体结合，能够拮抗血管紧张素Ⅱ对血管的收缩作用，从而舒张血管、降低血压[22]。而在慢性肾病病人中，apelin-13可以直接引起人脐静脉血管平滑肌细胞肌球蛋白轻链的增多，从而升高血压[23-24]。

综上所述，内源性apelin可双向调节丘脑底核神经元自发放电频率，以兴奋效应为主。本实验结果为进一步探讨丘脑底核内apelin及其受体系统可能作为运动相关疾病的潜在靶点提供了一定的理论和实验依据。