‘小白’草莓花药培养及组培快繁技术研究

孙行杰 吴忠娟 徐 英 崔丽静

（1山东省龙口市农业技术推广中心，烟台 265701；2山东省招远市毕郭镇党群服务中心，招远265412；3新泰市林业保护发展中心，新泰 271200；4海阳市果业发展服务中心，海阳 265100）

‘小白’是‘红颜’草莓脱毒组培芽变品种，2012年获世界草莓大会银奖，2014年通过北京种子中心审定[1]。果实长圆锥形，果皮粉色或浅红色，果肉纯白色，可溶性固形物含量13%～16%，有黄桃口味，果个大，平均单果重41.2 g，最大单果重135 g，生长旺盛，冬季连续结果性好，抗白粉病能力较强，667 m2产量3 500～5 000 kg。

近年来，国内电商的快速发展在很大程度上改变了草莓传统收购和销售方式，‘小白’硬度大，耐储藏，非常适合快递运输，而且口感极佳，因此种植面积不断扩大。生产中，草莓苗很容易受到病毒侵染引起品种退化，导致产量下降、品质变劣、抗病性减弱等，严重影响草莓种植效益[2]。目前，病毒病尚无有效药物可以治疗，只能通过栽植脱毒种苗进行防治。1974年日本大泽胜次首先证明草莓花药培养植株为正常倍性，且可脱除病毒，并作为培育无病毒苗木的方法之一[3]；还有研究证明花药培养所得的再生植株为脱毒植株，脱毒率为100%，可以省去病毒检测过程[4]。本研究通过对‘小白’草莓花药进行低温预处理、筛选合适的激素种类和配比的培养基，对草莓花药愈伤组织进行诱导和分化，获得‘小白’草莓脱毒原原种苗，再通过筛选适合的激素种类和配比的培养基对草莓丛生芽进行增殖和生根培养，建立‘小白’草莓花药培养技术体系，获得脱毒原原种苗，为草莓无病毒苗在生产上的应用提供可靠的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

以草莓品种‘小白’适龄花蕾为材料。11月中旬晴天上午7：00～8：00取正常植株上直径3～5 mm花蕾（镜检为单核靠边期），置于冰盒中带回实验室。

1.2 方法

1.2.1 ‘小白’草莓花蕾预处理 自来水冲洗30 min→蒸馏水冲洗2～3次→放入铺有湿润滤纸的培养皿中→密封后放入4 ℃冰箱中冷藏，低温处理24 h、48 h和72 h，标记为T1、T2和T3。对照不进行低温处理，标记为CK。

1.2.2 愈伤组织诱导 置于超净工作台上→75%酒精表面消毒30 s→无菌水冲洗2～3次→0.1% HgCl2消毒8 min→无菌水冲洗3次→去除花丝→剥取花药迅速接种于4种愈伤组织诱导培养基中（100 mL三角瓶）。花药愈伤组织诱导培养基为：MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 1.0 mg/L+IAA 2.0 mg/L；MS+6-BA 2.0 mg/L+KT 2.0 mg/L+IAA 4.0 mg/L；MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 1.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L；MS+6-BA 2.0 mg/L+KT 2.0 mg/L+NAA 4.0 mg/L，分别记做M1、M2、M3和M4。共16个处理，每处理接种5瓶，每瓶接种10个花药，重复3次。45 d后统计愈伤组织诱导率。

1.2.3 愈伤组织分化 将获得的‘小白’草莓愈伤组织转接至愈伤组织分化培养基中（500 mL培养瓶，下同），参照文献和预试验结果，花药愈伤组织分化选用的培养基为：MS+6-BA 0.5 mg/L+IAA 0.1 mg/L+GA 0.1 mg/L；MS+6-BA 0.5 mg/L+IAA 0.2 mg/L+GA 0.1 mg/L；MS+6-BA 0.5mg/L+IAA 0.1 mg/L+GA 0.2 mg/L；MS+6-BA 0.5 mg/L+IAA 0.2 mg/L+GA 0.2 mg/L，分别记做M5、M6、M7和M8。共4个处理，每处理10瓶，每瓶接种5个愈伤组织，重复3次。30 d后统计愈伤组织分化率。

1.2.4 丛生芽增殖 将获得的‘小白’草莓丛生芽转接至M5、M6、M7和M8培养基中，共4个处理，每处理接种3瓶，每瓶接种丛生芽1个，重复3次。接种20 d后统计增殖系数。

1.2.5 生根 选用的生根培养基为：1/2MS、1/2MS+IBA 0.1 mg/L、1/2MS+IBA 0.2 mg/L，分别记做M9、M10、M11。共3个处理，每处理5瓶，每瓶接种5株组培苗，重复3次。20 d后统计生根率。

1.2.6 培养条件 上述培养基除生根培养基中加入蔗糖20.0 g/L和活性炭0.5 g/L外，其它培养基中均加入蔗糖30.0 g/L，琼脂5.5 g/L，pH值为5.8；除愈伤组织诱导和分化两步接种后需先暗培养2 d外，其他培养条件均为每日光照16 h，光强2 000 lx，培养温度为25 ℃/20 ℃（昼/夜）

1.3 数据分析

采用SAS 9.0统计软件处理试验数据。

2 结果与分析

2.1 不同预处理时间、激素种类和配比对‘小白’花药愈伤组织诱导率的影响

由表1可以看出，在72 h内，低温预处理均显著提高了‘小白’花药愈伤组织诱导率，其中T1条件下即4 ℃低温预处理24 h效果最好；6-BA与KT、IAA和NAA的4种激素组合均提高了‘小白’花药愈伤组织诱导率，其中M2即MS+ 6-BA 2.0 mg/L+KT 2.0 mg/L+IAA 4.0 mg/L效果最好。综合来看，在T1预处理下，采用M2诱导培养基，‘小白’草莓花药愈伤组织诱导率最高，达到了75.33%，与其他处理差异性均达到了极显著（见表1）。

表1 不同预处理时间、激素种类和配比对‘小白’花药愈伤组织诱导率的影响

2.2 不同激素种类和配比对‘小白’花药愈伤组织分化、再生芽增殖的影响

从表2中可以看出，‘小白’草莓愈伤组织的分化率较低，在M6培养基即MS+6-BA 0.5 mg/L+IAA 0.2 mg/L+GA 0.1 mg/L中最高，达到18.67%，且丛生芽较大，玻璃化程度较轻；同时，其再生芽增殖系数也最高，达到了3.21，且再生芽长势健壮，无玻璃化现象。

表2 不同激素种类和配比对‘小白’花药愈伤组织分化、再生芽增殖的影响

2.3 不同激素种类和配比对‘小白’再生芽生根的影响

由表3可以看出，‘小白’草莓再生芽在M9培养基即1/2MS条件下生根率最高，达到94.67%，在M10培养基中平均根长最长，达到3.24 cm，须根数量也最多，平均7个，但3种培养基间生根率、平均根长、须根数量均无显著性差异，结合组织培养成本考虑，最佳生根培养基为1/2MS。

表3 不同激素种类和配比对‘小白’再生芽生根的影响

3 讨论与结论

草莓花药经过一段时间的低温预处理可以显著提高花药愈伤组织的诱导率，但不同品种间存在差异[5]。在本试验中，4 ℃低温预处理24 h对‘小白’草莓花药愈伤组织诱导效果最好，这与任建宏等[6]的研究结果一致，而与赵永钦等[7]结果不一致。

适当浓度的细胞分裂素与生长素配合使用，可以诱导草莓花药产生高质量的愈伤组织。在本试验中，6-BA、KT、IAA、NAA激素的4种组合均能促进‘小白’花药愈伤组织的形成，相同浓度下IAA效果好于NAA。而低温预处理24 h、6-BA 2.0 mg/L+KT 2.0 mg/L+IAA 4.0 mg/L的组合诱导率最高，达到了75.33%。

不同激素种类和配比对草莓愈伤组织分化和丛生芽增殖的影响不同。本试验中，在M6培养基即MS+6-BA 0.5 mg/L+IAA 0.2 mg/L+GA 0.1 mg/L激素组合处理下，‘小白’草莓花药愈伤组织分化率和丛生芽增殖系数均显著高于其他处理，分别达到18.67%和3.21，是适合‘小白’草莓花药愈伤组织分化与再生芽增殖的培养基配方。

草莓再生芽生根较为容易，本试验中，‘小白’草莓再生芽在3种培养基中生根率都达到了90%以上，相互间无显著性差异，这与杨振英等[8]研究结果不同，可能是由于‘小白’草莓生长势较强，对外源激素依赖程度较低的原因。因此，直接选用不添加任何激素的1/2MS培养基即可满足‘小白’草莓再生芽的生根需要。