FNDC1在胃腺癌中的表达及对细胞增殖的调控

任恒杰，王忠利

(锦州医科大学附属第一医院，辽宁 锦州 121000)

胃癌是消化系统常见的肿瘤之一，多见于中老年人。在我国其发病率位居常见肿瘤的第二位，死亡率位居第三位，严重威胁人们的健康和生命。胃癌主要是起源于粘膜上皮细胞，临床表现为腹胀、嗳气、恶心等缺乏特异性的上消化道症状，由于上述表现与胃溃疡、胃炎等良性疾病症状相似而被患者忽视。我国早期胃癌的检出率较低,临床确诊的病例多为进展期胃癌。胃腺癌是最为常见的病理类型，手术是主要治疗方法，但是对于出现远处转移及局部复发丧失手术机会的患者来说，全身化疗是治疗的重要方式，但是化疗敏感性较差，主要与胃腺癌是高增殖性、高侵袭性肿瘤相关，而高增殖性及高侵袭性可能贯穿于肿瘤形成和进展的始终，也是预后不良的重要分子因素[1]。增殖细胞核抗原(PCNA)是肿瘤细胞增殖的重要标志因子，常受上游多种基因的调控[2]。III型纤维连接蛋白结构域1(FNDC1)是G蛋白β、γ亚基的独立辅助性蛋白受体[3]，也是近年人们关注的与肿瘤增殖和转移相关的因子，可以通过多种途径促进肿瘤进展[4]。本实验基于胃腺癌进行实验设计，检测肿瘤中FNDC1的表达特征，分析其临床意义，探讨对细胞增殖的调控作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2015年1月至2016年10月期间在锦州医科大学附属第一医院诊断为胃腺癌，并行根治手术的患者。纳入标准：(1)术后切片均病理医师复审进一步明确，符合WHO中的诊断标准；(2)临床资料完整。排除标准：(1)术前行放、化疗者；(2)严重内科疾病者；(3)既往有消化系统手术史。共选择67例，其中男性35例，女性32例，年龄35～88岁，平均年龄(59.7±6.9)岁，中位年龄59岁。留取术后肿瘤组织和距肿物边缘>3 cm的正常胃粘膜组织(石蜡包埋组织)。研究经医院医学伦理委员会同意。

1.2 细胞系

选择的胃癌细胞株MGC803购于中科院上海细胞库。在37 ℃、5%CO2的湿润培养箱中培养，应用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在细胞密度约70%～90%时，进行传代培养，倒置显微镜观察细胞的生长状态。

1.3 免疫组化实验

应用免疫组化EnVision法检测肿瘤组织和正常胃粘膜组织中FNDC1、肿瘤组织中PCNA的表达。FNDC1为浓缩液(K8002)，购自Dako公司，PCNA为浓缩液，购自苏州睿瀛公司(RLM3031)，不同梯度稀释后先行预实验观察，选择显色最理想的浓度进行正式实验(FNDC1是1∶50，PCNA是1∶100)，DAB显色，严格按实验步骤手工操作，均由同一病理技师完成。

判读方法：FNDC1和PCNA的阳性部位为肿瘤细胞核，以黄色、棕黄色及棕褐色为阳性，随机选择5个400倍视野(热点区)进行观察计数。以阳性率≤25%为阴性，以>26%为阳性。

1.4 细胞系构建

根据Lipofectamine 3000转染试剂使用说明将人工合成的siRNA-FNDC1小干扰质粒和无关序列转染到MGC-803细胞中，分别建立siRNA-FNDC1组及空载体转染组，同时设立空白对照组。

1.5 CCK-8实验

将对数生长期的细胞用胰酶消化，制备成细胞悬液，接种于96 孔板中(>5000个细胞/每孔)，每组设置3个复孔，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。待细胞均匀铺于孔底70%左右时，根据实验分组对细胞进行转染，孵育24 h后，在避光环境中加入10 μL的CCK-8试剂，继续培养2 h后应用酶标仪测定450 nm波长下各组细胞的OD值。

1.6 RT-qPCR实验

应用实时定量荧光PCR(RT-qPCR)法检测PCNA mRNA的表达。TRIzol提取各组细胞的总RNA，验证纯度。逆转录法获得总的cDNA。引物上游：5′-TCTATCGATGATATAAACGAGTTCCGCT-3′，下游：5′-GCTGATAGTAGTAGATGCCCATGCCAG-3′。U6为内参，上游：5′-CTACGCTTCGCACAATCAACTGA-3′，下游：5′-GCTGTGCAGCGA GGTATCGT-3′。PCR执行程序：95 ℃预变性30 s后，变性95 ℃ 30 s，退火60 ℃ 10 s，延伸72 ℃ 30 s，共35个循环，72 ℃延伸5 min。实验重复3次。结果以2-ΔΔCt表示。

1.7 统计学方法

数据均应用SAS 6.12软件进行分析，定量资料行正态性检验，两组间比较应用t检验，多组间比较行方差分析，并应用SNK法行两两比较，率的比较应用卡方检验，应用K-M生存分析及线性相关分析，均以α=0.05为检验水准。

2 结 果

2.1 生物信息分析

GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)数据库行生物信息分析，显示相对于正常组织，FNDC1在胃腺癌中的表达可能有增高趋势，见图1。

图1 生物信息分析结果图(GEPIA)

2.2 胃腺癌和正常胃粘膜组织中FNDC1阳性率表达的比较

两组中FNDC1表达的阳性率差异有统计学意义(P<0.001)，即胃腺癌中FNDC1高表达，见表1、图2。

表1 胃腺癌和正常胃粘膜组织中FNDC1阳性率的比较[n(%)]

A：FNDC1在胃腺癌中阳性；B：FNDC1在正常胃粘膜组织中阴性图2 胃腺癌和正常胃粘膜组织中FNDC1的表达(200×)

2.3 FNDC1在胃腺癌不同临床特征分组中表达的比较

胃腺癌中FNDC1的阳性率在不同肿瘤最大径、淋巴结转移和浸润深度的比较中差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 FNDC1在不同临床特征分组中阳性率的比较[n(%)]

2.4 胃腺癌中FNDC1和PCNA的相关性

胃腺癌中PCNA的阳性率范围为5%～85%，平均43.1%。线性相关分析显示FNDC1和PCNA的评分具有正相关性(r=0.65，P=0.023)，见图3～4。

图3 PCNA表达(免疫组化EnVision法)

r=0.65，P=0.023图4 胃腺癌中FNDC1和PCNA的相关性

2.5 胃腺癌中FNDC1表达的生存分析

患者均进行术后60个月生存时间的随访，应用门诊、电话及上门随访的形式。截止时间点为2011年10月31日。其中因非胃癌死亡者1例，失访2例(此3例计为删失值)。应用K-M生存分析显示FNDC1与生存时间有关(FNDC1阳性率的临界值为25%，χ2=6.73，P=0.010)，即FNDC1高表达时生存时间短，预后差；FNDC1低表达时生存时间长，预后好，见图5。

图5 生存分析图

2.6 不同组别不同时点胃癌细胞系中细胞增殖活性的比较

siRNA-FNDC1组于48 h时开始细胞增殖活性明显低于空白对照组和空载体转染组(P<0.05)，并持续至96 h，见图6。

图6 不同组别不同时点胃癌细胞系中细胞增殖活性的比较

2.7 不同组别细胞系中PCNA mRNA表达的比较

siRNA-FNDC1组PCNA mRNA表达(1.01±0.23)明显低于空白对照组(1.50±0.29)和空载体转染组(1.48±0.34)(F=5.94，P=0.001)，见图7。

*P<0.05图7 不同组别细胞系中PCNA mRNA表达的比较

3 讨 论

胃粘膜表面被覆腺上皮细胞，腺上皮异型增生后形成浸润性癌[5-6]。癌细胞具有高增殖活性，且大部分肿瘤的分化差，表现为易于生长和侵袭。胃腺癌病理切片镜下表现为弥漫性生长，细胞间连接松散[7-8]。PCNA是经典的标记增殖指标的因子，可以反应腺上皮细胞增殖的活跃程度。FNDC1是近年关注到的与肿瘤生物学行为密切相关的基因，生物信息学分析其可能与胃腺癌的形成有关。FNDC1基因全长1894 bp，分子量205 kDa，为一种蛋白编码与恶性疾病相关的因子，ABI3BP是基因的产物之一，可以激活G蛋白[9-10]，作为信号转导因子中正向调控因子发挥促进肿瘤进展的作用[11]。

研究结果显示胃腺癌组织中FNDC1表达的阳性率明显高于对照组，提示FNDC1表达升高是胃腺癌形成过程中的重要分子事件，即FNDC1具有癌基因样的作用。结果显示胃腺癌中FNDC1的阳性率在不同肿瘤最大径、淋巴结转移和浸润深度的比较中差异有统计学意义，提示FNDC1高表达可以促进肿瘤的生长、淋巴结转移及局部侵袭，FNDC1是肿瘤进展的标志因子。FNDC1 具有纤维连接蛋白成份，其是肿瘤形成的调控因子之一[12]，有研究显示纤维连接蛋白在肿瘤形成和转移中有重要作用，主要受血管生长因子的调节，即FNDC1对肿瘤的血管新生有作用，这为肿瘤组织在生长过程中接受更多血液灌注提供了条件[13]，也为肿瘤生长提供了必要的营养和氧的支持，也加速了肿瘤的侵袭。FNDC1在肿瘤中的作用与增加血管通透性和减少内皮细胞的凋亡有关[14]。FNDC1在促进肿瘤形成过程中受上下游多种因子的共同调控，因此其调控机制复杂。顾园等[15]研究发现miRNA-6783-3p等非编码RNA是FNDC1的上游因子，二者具有靶向负向调控作用。FNDC1对肿瘤间质的调节作用可能更强，包括对细胞外基质的降解和细胞粘附的调节等[16-17]。结果显示胃腺癌中FNDC1与PCNA具有正相关性，且经体外细胞实验证实了干扰FNDC1的表达对细胞增殖活性形成明显抑制作用，提示FNDC1促进肿瘤形成和进展与对细胞增殖的促进作用有关[18]。结果显示FNDC1的表达与胃腺癌的预后有关，提示临床检测FNDC1的表达对判断预后可能有一定价值，这与Zhong等[19]的研究结论较为一致，但是其临界值有待后续进行大样本及多中心性的研究进一步明确。

综上所述，FNDC1在胃腺癌中表达升高，参与肿瘤的形成和进展。FNDC1的作用可能与促进肿瘤细胞的增殖有关。检测胃腺癌组织中FNDC1的表达可能对判断预后有一定价值。