胸腔积液游离核酸检测在结核性胸膜炎早期诊断中的价值

张芸 李琨 梁清涛 刘子臣 段鸿飞 李雪莲 郭茹 车南颖 杨新婷

结核性胸膜炎是结核分枝杆菌及其代谢产物进入胸膜腔引起的胸膜炎症反应［1］。结核性胸膜炎多见于青年男性，最常见的临床表现是发热、胸疼、咳嗽及活动后呼吸困难［2］。《WS 288—2017 肺结核诊断》［3］中明确提出胸腔积液查到结核分枝杆菌或其核酸检测阳性是结核性胸膜炎确诊的依据。由于结核性胸膜炎胸腔积液含菌量少的特点，结核性胸膜炎患者胸腔积液中查到抗酸杆菌的阳性率不足5%，分枝杆菌培养阳性率也仅为30%，而且培养仍需4～8周时间［4-5］。世界卫生组织（World Health Organization，WHO）推荐诊断结核病的检测方法GeneXpert MTB/RIF阳性率也仅有34%～51%［6-7］。而临床上常用的生化检测指标，例如腺苷脱氨酶（adenosine deaminase，ADA）和结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB），虽敏感度较高，但其特异度较差［8-9］。闭式胸膜活检和内科胸腔镜虽能通过获取胸膜组织使结核性胸膜炎诊断率提高至85%以上，但因其为有创检查，难以在临床广泛应用［10-11］。因此，临床迫切需要更灵敏快速的病原学诊断技术应用于结核性胸膜炎的早期确诊。

游离核酸（cell-free DNA，cf-DNA）是存在于生物体液中无细胞状态的胞外DNA 片段，可存在于机体任何体液中［12］。cf-DNA 作为新的生物标志物，最早应用于产前胎儿排除畸形检查中。随后该技术被广泛用于自身免疫疾病和肿瘤的治疗、预后、复发等相关领域［13］。最近研究发现，血浆cf-DNA也存在引起机体不同部位感染的多种细菌、真菌和寄生虫等病原体基因组DNA 片段，显示其可能成为诊断感染性疾病的新技术［14-15］。随着对结核分枝杆菌认识的加深，人们了解到该菌在正常代谢、凋亡或被破坏后可释放其特异cf-DNA 片段IS6110。IS6110不仅在结核分枝杆菌复合群中拷贝数多、降解迅速，而且可通过PCR 技术被检测到［16-17］。因此，笔者推测通过检测胸腔积液结核分枝杆菌游离核酸（cell-freeMycobacterium tuberculosisDNA test，CF.TB）可能会更敏感和特异地诊断结核性胸膜炎。笔者前期在小样本的临床试验中证实了结核性胸膜炎患者胸腔积液中不仅能检测到IS6110，而且CF.TB 检测可用于结核性胸膜炎的早期诊断［18］。但此技术诊断结核性胸膜炎的敏感度是否优于临床上常用的生化指标和传统核酸扩增技术（nucleic acid amplification test，NAAT）尚缺乏临床观察数据。笔者拟通过对2016年7月至2018年12月连续住院的不明原因胸腔积液患者同时行胸腔积液CF.TB、RNA 恒温扩增实时检测技术（simultaneous amplification and testing，SAT-PCR）、GeneXpert MTB/RIF、ADA 及血T-SPOT.TB 检测，评价CF.TB对结核性胸膜炎早期诊断的价值，同时探讨CF.TB技术单独或联合ADA 对临床表现不典型的结核性胸膜炎早期诊断价值，为临床推广提供循证医学依据。

对象和方法

一、研究对象

选择2016年7月至2018年12月首都医科大学附属北京胸科医院连续住院的216例不明原因胸腔积液患者为研究对象，其中，男153例，女63例，年龄15～91岁，中位年龄为46岁，1例患者HIV检测阳性。纳入患者入院时均进行外周血TSPOT.TB检测、胸部X线或CT检查、胸部彩色多普勒超声检查及呼吸道（痰或支气管灌洗液）GeneXpert MTB/RIF检测、BACTEC MGIT 960培养、分枝杆菌罗氏培养。入院后行胸腔穿刺术或胸腔置管术，留取胸腔积液，并对胸腔积液进行常规、生化检测、病理学检查以及CF.TB、SAT-PCR、GeneXpert MTB/RIF 检测。所有患者至少随访12个月以明确最终的诊断信息。

二、研究方法

1.结核性胸膜炎诊断标准：采用临床复合标准（composite reference standard，CRS）作为参考标准［3］，即指符合Light诊断标准的渗出性胸腔积液，且满足以下标准之一。（1）胸腔积液或胸膜组织分离出结核分枝杆菌或其核酸检测阳性；（2）胸膜组织病理学明确找到干酪样坏死或不典型肉芽肿，伴或不伴抗酸染色阳性且抗结核治疗有效并随访至少12个月；（3）痰或支气管灌洗液涂片或GeneXpert MTB/RIF阳性或分枝杆菌培养阳性；（4）患者有发热、咳嗽、咳痰、乏力、盗汗等结核中毒症状，胸腔积液为渗出性、ADA增高伴有结核菌素纯蛋白衍生物（PPD）皮肤试验中度以上阳性或抗结核抗体阳性或血T-SPOT.TB检测阳性，经临床医生判断为结核性胸膜炎且抗结核治疗有效并随访至少12个月。

2.其他病因胸腔积液：（1）恶性胸腔积液：胸腔积液或胸膜组织中检测到恶性肿瘤细胞；（2）其他病因所致胸腔积液：有明确病因的胸腔积液且未接受抗结核治疗并至少随访12个月。

3.分组：根据患者最终诊断结果将患者分为结核性胸膜炎组和非结核性胸膜炎组。非结核性胸膜炎组包括恶性胸腔积液、感染性胸腔积液和其他病因胸腔积液（胞内分枝杆菌感染、结节病、结缔组织病、梅格斯综合征）。

4.胸腔积液实验室检测技术与方法：（1）CF.TB检测：①样本准备：采集40 ml胸腔积液，通过4℃3000×g离心10 min留取上清液5 ml，再通过4℃16 000×g离心10 min，留取上清液，用于游离核酸提取；②游离核酸提取：按照游离核酸提取试剂盒（Qiagen Hilden，Germany）的要求按步骤进行操作提取胸腔积液cf-DNA；③检测：使用结核分枝杆菌实时荧光定量PCR试剂盒（广州达安生物工程股份有限公司）检测上清液中结核分枝杆菌目的基因片段IS6110，然后进行定量分析。（2）SAT-PCR 检测：采集5 ml胸腔积液经3000×g离心10 min留取细胞沉淀，然后按1∶100的比例用稀释液进行稀释，采用实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒（上海仁度生物科技有限公司）的要求按步骤进行操作。（3）GeneXpert MTB/RIF 检测：50 ml胸腔积液经3000×g离心10 min弃上清，保留沉渣。向沉渣中加入2 ml标本处理液振荡均匀后转入有螺旋盖的无菌管中，室温放置15 min。然后取2 ml液化标本至GeneXpert MTB/RIF反应试剂盒，并将其置于GeneXpert检测仪器（美国Cepheid公司）中，2 h内仪器自动完成检测。（4）T-SPOT.TB 检测：按照T-SPOT.TB试剂盒（英国牛津Immunotec公司）说明书进行操作。以斑点形成细胞（spot forming cells，SFC）计数，我院临床所用参考值为早期分泌抗原靶蛋白6（early secreted antigenic target of 6 kDa，ESAT-6）或培养滤液蛋白10（culture filtrate protein-10，CFP-10）任一个≥24 SFC/106即为T-SPOT.TB阳性。（5）BACTEC MGIT 960培养：取10 ml胸腔积液经3000×g离心10 min后弃上清，保留沉渣。沉渣经标本处理液处理后取0.5 ml放于BACTEC MGIT 960全自动快速分枝杆菌培养鉴定药敏仪（美国BD 公司）中培养42 d，仪器报告阳性后，取培养液进行涂片镜检，若发现抗酸杆菌则为阳性，若未发现抗酸杆菌则为阴性。（6）分枝杆菌罗氏培养：取10 ml胸腔积液经3000×g离心10 min后，保留沉渣。沉渣经前标本处理液处理后，取0.1 ml按照《结核病实验室检验规程》［19］制定的菌株分离培养方法进行检测和报告。

5.结核性胸膜炎患者亚组分组方法：典型结核性胸膜炎患者常具有青年男性、合并肺结核、胸腔积液ADA≥40 U/L 等临床特点［20］。这些临床特点常是诊断结核性胸膜炎的重要参考指标。因而，缺乏上述临床特点的不典型结核性胸膜炎患者常诊断困难。亚组分组方法：（1）根据患者年龄分为青年组（15～39岁）、中年组（40～59岁）和老年组（≥60岁）；按是否合并肺结核分为肺结核组和无肺结核组；按呼吸道病原学检测结果分为阳性组、无痰或阴性组；按ADA结果分为ADA≥40 U/L组和ADA＜40 U/L组；按性别分为男性组和女性组；（2）按照临床特点分为典型结核性胸膜炎患者和非典型结核性胸膜炎患者。典型胸膜炎患者临床特点包括以下之一：①年龄为中青年；②合并肺结核；③呼吸道病原学阳性；④ADA≥40 U/L；⑤男性。非典型胸膜炎患者临床特点包括以下之一：①年龄为老年；②无肺结核；③呼吸道病原学阴性；④ADA＜40 U/L；⑤女性。

6.胸腔镜检查：术前患者均进行胸部CT、彩色多普勒超声检查，明确患者胸腔积液量和膈肌位置。术中患者一般选择健侧卧位，患侧腋中线与第5～8肋间交叉点为合适的进镜点。常规消毒麻醉，切开皮肤1～2 cm，逐层皮下钝性分离肌肉进入胸腔，插入LTF240胸腔镜（日本Olympus公司），吸出胸腔积液，然后对壁层胸膜行多点活检。操作结束后退出胸腔镜并放置闭式引流管，缝合切口。观察患者生命体征。最后将胸膜标本进行病理学和病原学检测。

三、统计学处理

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，对计量资料符合正态分布者以“”描述，偏态资料采用“中位数（四分位数）［M（Q1，Q3）］”描述。两组均数的比较采用t检验，中位数的比较采用秩和检验。亚组之间样本率的比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

一、研究对象一般资料

216例患者中165例临床确诊为结核性胸膜炎，其中胸腔积液MGIT 960 培养阳性25 例（15.15%，25/165），痰或BALF GeneXpert MTB/RIF检测阳性49例（29.70%，49/165），经胸膜活检确诊21例（12.73%，21/165），其他70例（42.42%，70/165）无病原学证据。51例确诊为非结核性胸膜炎患者，其中恶性胸腔积液39 例（76.47%），包括腺癌20例、恶性间皮瘤14例、淋巴瘤2例、鳞癌1例、胸腺瘤1 例、前列腺癌1 例；感染性胸腔积液8 例（15.69%），其他原因4例，包括胞内分枝杆菌感染、结节病、结缔组织病、梅格斯综合征各1例。

二、结核性胸膜炎组和非结核性胸膜炎组患者的临床资料

结核性胸膜炎组患者中位年龄（40岁）明显低于非结核性胸膜炎组（58岁），而且男性患者明显多于非结核性胸膜炎组，其男性患者占76.36%（126/165）。结核性胸膜炎组患者血清T-SPOT.TB阳性率（87.27%）明显高于非结核性胸膜炎患者（37.25%），差异有统计学意义（表1）。

表1 两组患者临床资料

三、胸腔积液CF.TB、SAT-PCR和GeneXpert MTB/RIF 3种分子生物学检测方法在结核性胸膜炎中诊断效能的评价

以CRS 为参考标准，比较CF.TB、SAT-PCR和GeneXpert MTB/RIF 3 种检测方法的诊断效能。胸腔积液CF.TB、SAT-PCR 和GeneXpert MTB/RIF方法诊断结核性胸膜炎的敏感度分别为70.30%（116/165）、7.88%（13/165）和12.12%（20/165）。CF.TB检测敏感度明显高于SAT-PCR、GeneXpert MTB/RIF，差异均有统计学意义（χ2=1.350、1.153，P值均=0.000），而且CF.TB 敏感度也明显高于分枝杆菌培养（15.15%，25/165），差异有统计学意义（χ2=1.012，P=0.000）；SATPCR的敏感度略低于GeneXpert MTB/RIF，但差异无统计学差异（χ2=1.650，P=0.199）（表2）。3种诊断方法检测敏感度进行交叉比较，结果显示12例患者SAT-PCR 检测和CF.TB 检测同时阳性，19例患者GeneXpert MTB/RIF检测和CF.TB检测同时阳性。

表2 以CRS为参考标准评价三种检测方法的诊断效能

四、胸腔积液CF.TB与ADA、T-SPOT.TB对结核性胸膜炎的诊断价值

以CRS 为参考标准，比较CF.TB、ADA、T-SPOT.TB的诊断效能。胸腔积液CF.TB、ADA和血T-SPOT.TB方法诊断结核性胸膜炎的敏感度分别为70.30%（116/165）、67.27%（111/165）和87.27%（144/165）。CF.TB检测敏感度明显高于ADA，但低于T-SPOT.TB，差异均有统计学意义（χ2=1.025、1.264，P值均=0.000）。CF.TB 与ADA两种方法联合检测对结核性胸膜炎诊断的敏感度为88.48%（146/165），其敏感度明显高于CF.TB单独检测，差异有统计学意义（χ2=16.670，P=0.000）（表3）。

表3 以CRS为参考标准评价CF.TB和ADA方法的诊断效能

五、胸腔积液CF.TB对不典型结核性胸膜炎患者的诊断价值

CF.TB、SAT-PCR、GeneXpert MTB/RIF方法对结核性胸膜炎患者年龄、性别、是否合并肺结核、呼吸道病原学及ADA 各亚组的敏感度进行分析，结果显示这三种检测方法在各亚组中检测敏感度差异均无统计学意义。但CF.TB在不典型结核性胸膜炎患者各亚组中均有较高的敏感度，在不合并肺结核组、无痰或呼吸道病原学阴性组、胸腔积液ADA＜40 U/L 组、中年及老年组阳性率分别为61.02%（36/59）、68.97%（80/116）、64.81%（35/54）、70.83%（34/48）及61.11%（22/36），提示CF.TB检测对临床不典型结核性胸膜炎患者的早期诊断有较高价值（表4）。

表4 三种检测方法在结核性胸膜炎各亚组中的诊断价值

续表4

六、胸腔积液CF.TB检测降低有创检查

21例结核性胸膜炎患者是通过内科胸腔镜或胸膜活检检查而确诊。21 例患者中15 例患者（71.43%）胸腔积液CF.TB检测阳性。

讨 论

结核性胸膜炎是结核分枝杆菌侵犯胸膜引起的胸膜IV型变态反应，是我国胸腔积液最常见的原因［1］。但因结核性胸膜炎患者胸腔积液中含菌量低，目前临床常用NAAT检测方法很难在胸腔积液中找到病原学证据，达到早期诊断结核性胸膜炎的目的，亟需寻找新的分子生物学诊断方法。CF.TB是近年出现的一种新型分子生物学诊断方法［16-17］。本研究通过纳入216例不明原因胸腔积液患者，分析了CF.TB对结核性胸膜炎的诊断价值。结果发现以CRS为参考标准，胸腔积液CF.TB诊断结核性胸膜炎的敏感度（70.30%）明显高于SAT-PCR（7.88%）、GeneXpert MTB/RIF（12.12%）及ADA（67.27%），而且该方法能降低临床胸腔镜或胸膜活检等有创检查的使用。

cf-DNA是由凋亡或坏死细胞释放到细胞外的小分子DNA 片段，可存在于人类血清、血浆、脑脊液、尿液、唾液及各种体液［12］。cf-DNA 检测目前在孕妇产前诊断、肿瘤检测、器官移植术后排斥和感染检测等领域广泛应用［13-15］。CF.TB是通过检测结核分枝杆菌复合群特异性cf-DNA 而建立的一种新的结核分枝杆菌检测方法［18］。该技术靶基因是结核分枝杆菌特异性插入序列IS6110，该片段在结核分枝杆菌中不仅拷贝数多，而且降解迅速，不同于传统NAAT检测方法（例如GeneXpert MTB/RIF和SAT-PCR）。GeneXpert MTB/RIF是一种可在2 h内完成结核分枝杆菌基因和利福平耐药检测的全自动实时定量PCR技术，其检测结核分枝杆菌靶基因是基于利福平耐药基因决定区rpoB基因［21］。SAT-PCR技术是新一代恒温RNA 扩增技术，其是以结核分枝杆菌特异16S rRNA 为靶基因［22］。CF.TB作为一种新的诊断方法，在肺结核及肺外结核中的诊断价值尚不清楚。Yu等［23］研究CF.TB在肺结核和肺外结核中的诊断价值，显示以CRS为参考标准，其诊断肺结核和肺外结核的敏感度分别为78%和65%，而且血浆CF.TB敏感度高于非血浆（胸腔积液、脑脊液、腹腔积液），提示CF.TB对结核性胸膜炎可能具有较好诊断价值。由于结核性胸膜炎是结核分枝杆菌直接感染胸膜或其代谢物进入机体胸膜腔而引起胸膜的局部免疫反应［1］，胸腔积液CF.TB 检测结核分枝杆菌阳性率应高于血液。为此，本研究比较了胸腔积液CF.TB方法与传统NAAT方法在结核性胸膜炎中的诊断价值，结果显示以CRS为参考标准，CF.TB方法诊断结核性胸膜炎的敏感度（70.30%）远高于SAT-PCR 技术（7.88%）和GeneXpert MTB/RIF技术（12.12%）。CF.TB较上述传统NAAT方法敏感度高的原因可能有以下几点：（1）传统NAAT 检测靶基因是结核分枝杆菌基因组DNA，而CF.TB检测是结核分枝杆菌插入序列片段IS6110。结核性胸膜炎患者胸腔内结核分枝杆菌含量较低，TB-DNA 不容易检测，而IS6110 拷贝数却较高，容易检测。Yang等［24］研究显示CF.TB方法检测结核分枝杆菌的最低下限为1.25 CFU/μl，而以往文献研究报道GeneXpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌最低浓度为112.6 CFU/ml［7，21］，说明CF.TB检测结核分枝杆菌下限远远低于传统NAAT 方法；（2）cf-DNA稳定性较基因组DNA 差。研究表明胎儿cf-DNA 1～2 d内就从母体血浆和尿液里被清除，而各种病原体cf-DNA当被治疗后也能很快被机体清除，说明cf-DNA能反映机体最近的感染状态［25-26］。这些结果提示CF.TB对结核性胸膜炎具有较好的诊断价值。

CF.TB作为一种新的分子生物学方法，其操作方法较传统NAAT相对简单，而且价格也仅为传统NAAT的一半。对于病原学诊断困难的结核性胸膜炎患者，CF.TB可能成为其辅助诊断的方法。为此，笔者将CF.TB、GeneXpert MTB/RIF和SATPCR这3种方法在结核性胸膜炎中的诊断效能进行交叉分析比较，结果显示12例患者SAT-PCR检测和CF.TB检测同时阳性，19例患者GeneXpert MTB/RIF检测和CF.TB检测同时阳性。这些结果提示CF.TB 可作为结核性胸膜炎的辅助诊断方法。

胸腔积液ADA 和血T-SPOT.TB是临床上诊断结核性胸膜炎常用的生物学标志物［8-9，27］。本研究比较了CF.TB和ADA、T-SPOT.TB检测在结核性胸膜炎中诊断价值，结果显示CF.TB诊断结核性胸膜炎的敏感度（70.30%）高于ADA（67.27%），低于T-SPOT.TB（87.27%），但其特异度（100.00%）明显高于ADA（92.16%）和TSPOT.TB（62.75%）。若将CF.TB和ADA 两者联合，可明显提高其诊断结核性胸膜炎的敏感度（88.48%）。ADA对结核性胸膜炎诊断的特异度差的原因可能因为ADA是一种与机体免疫细胞活性有重要关系的嘌呤核苷代谢酶。胸腔积液ADA 升高可见于多种疾病（例如结核性胸膜炎、脓胸、肺癌、淋巴瘤、类风湿性关节炎等）。本研究中有4例非结核性胸膜炎患者ADA＞40 U/L。而T-SPOT.TB特异度差可能与我国是结核分枝杆菌潜伏感染高危区有关。本研究中有37.25%（19/51）非结核性胸膜炎患者T-SPOT.TB阳性。这些结果提示CF.TB对结核性胸膜炎较ADA 有更好的诊断价值，CF.TB与ADA联合检测可大幅度提高结核性胸膜炎的早期诊断，CF-TB不受结核分枝杆菌潜伏感染的影响。

典型结核性胸膜炎患者结合临床表现和实验室检查可获得临床诊断。但对于临床表现不典型、胸腔积液ADA达不到诊断界值、痰或呼吸道病原学阴性等不典型结核性胸膜炎患者很难达到临床诊断。本研究165例结核性胸膜炎患者中，仅有57.58%（95/165）患者通过痰、BALF、胸腔积液或胸膜组织获得病原学证据，其他42.42%（70/165）患者仍需结合其他辅助方法和诊断性抗结核治疗等结果进行临床诊断。因此，本研究回顾性分析CF.TB对上述不典型结核性胸膜炎患者的诊断价值。结果显示，CF.TB方法对不典型结核性胸膜炎患者诊断阳性率也高达60%～70%。而且在需行内科胸腔镜检查才确诊的结核性胸膜炎患者中，有71.43%（15/21）的患者CF.TB检测阳性。这些结果提示CF.TB在临床应用中具有广泛适用性，可有效减少临床有创检查。本研究还存在不足之处：本研究为单中心诊断试验，而且研究中心为结核病专科医院，可能导致结果有局限性，还需大样本多中心临床研究进一步验证。

综上所述，胸腔积液CF.TB检测是一种新的灵敏、特异、快速、简便的分子生物学诊断技术，其诊断结核性胸膜炎的敏感度优于传统NAAT方法，可推荐用于病原学获得困难的患者（如肺外结核、胸膜炎、儿童/年老体弱无法取痰者等）的辅助诊断，而且CF.TB与ADA 联合能有效提高结核性胸膜炎的早期诊断。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献张芸、李琨、梁清涛：数据的采集与分析，论文撰写和修改；刘子臣：标本的检测；段鸿飞、李雪莲、郭茹：标本收集；车南颖、杨新婷：实验设计和实施实验、论文修改及研究经费支持