紫云英腐解液对牛筋草种子萌发及幼苗生长的影响

刘思林，陈俊雪，杨阳，陈中文，卢玲玲，牟英辉，2*

（1. 华南农业大学农学院，广东 广州 510642；2. 农业农村部华南地区作物栽培科学观测实验站，广东 广州 510642）

牛筋草（Eleusine indica）是一年生禾本科穇属植物，在农业生产上属于危害作物生长的一种世界性杂草［1］。在一些适宜牛筋草生长的区域，牛筋草以强大的繁殖力及抗性演变成为恶性杂草。近年来，由于过度地使用除草剂，使得牛筋草产生了极强的抗药性［2-3］，这迫切需要寻找能够减少除草剂使用的其他形式的控草方法。紫云英（Astragalus sinicus）是豆科黄耆属二年生草本植物，是一种重要的绿肥作物。冬种紫云英可以提高土壤肥力［4-8］、减少化肥施用［9-11］、改善土壤理化性质［12-15］以及保持水土［16-17］。此外，间套作紫云英可以提高目标作物的品质［13］、产量［10，18-19］和抗病虫害能力［20］。由此可见，紫云英的研究关注点在于其对作物生长、土壤理化性质及病虫害的影响方面，而关于紫云英对杂草的抑制作用，尤其是还田后的残枝腐解物对后茬作物田间杂草防控方面的研究甚少。本研究以绿肥翻压还田的利用方式作为切入点，结合前人研究及田间观察设计了腐解物控草试验，以期找到紫云英腐解规律，明确紫云英腐解物对牛筋草的影响，为农业生产上合理地利用和开发紫云英这一生物资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

KES 2.0 人工气候箱、恒温摇床、YLD-561 型游标卡尺（德国）、PIP 9.1 显微镜（广东珠海）、高压灭菌锅、BSA224S 型万分之一电子天平（德国）、SX711 型pH 计（上海）和SW-301 型电导率计（广东广州）。

1.2 材料

试验用紫云英种子由御景园绿化工程有限公司提供。2020 年7 月，在人工气候培养箱中播种紫云英，设置温度（23±2）℃，湿度75%，12 h/12 h 光暗周期，期间保持土壤湿润，并于同年9 月收集紫云英秸秆，在自然条件下风干，粉碎，室温下密闭干燥备用。牛筋草种子由华南农业大学农学院陈勇老师实验室提供，采集于华南农业大学增城实验基地（23°14′18.42″N，113°38′8.06″E）。

1.3 器材灭菌与种子消毒

将镊子、滤纸和培养皿放入高压灭菌锅内，经过121 ℃，0.1 MPa 条件下灭菌20 min，待灭菌锅气压降至常压时取出，放置于较为干净的无菌橱或实验室内冷却备用。将种子放进75%乙醇中处理30 s，期间适当振荡，消毒完毕用无菌水冲洗2 次，再放入已配制好的浓度为2.2%的次氯酸钠溶液中，置于恒温振荡培养箱中振荡灭菌12 min。种子灭菌完毕后取出，用无菌水冲洗5 次。

1.4 试验设计

1.4.1紫云英腐解液对牛筋草种子萌发和幼苗生长的影响 将风干后的紫云英全株粉末按粉末∶土∶水=1∶1∶30（m∶m∶v）混合，装入具盖的广口塑料瓶中，以不添加紫云英粉末的土壤溶液作为对照（CK），放置于28 ℃200 r·min-1的恒温摇床中分别腐解2、3、7 和15 d，获得紫云英腐解液。腐解液及对照经滤纸过滤以及12000 r·min-1离心10 min，取上清液用0.22 μm 的微孔滤膜过滤，得到的除菌腐解液用灭菌超纯水配制成2%、5%、30%和80%浓度梯度培养液。种子萌发采用双层滤纸法，处理组每个皿加2 mL 培养液，对照组（CK）加等量对照溶液，每个处理5 个重复，每个皿接种30 粒种子，放置于28 ℃恒温培养箱中，相对湿度控制在75%左右，暗培养。每天下午5 点观察并统计一次数据，补充培养皿内的水分。以胚根出现作为种子发芽标志，3 d 内发芽总数不变时停止统计发芽率并测定幼苗生理指标。

1.4.2紫云英腐解液对牛筋草幼苗的化感作用 用腐解15 d 的紫云英腐解液配制成2%、5%、30%和80%（V∶V）浓度梯度培养液，对生长于基质中2 周的两叶期牛筋草幼苗进行灌根处理，对照组（CK）以不含紫云英粉末的土壤溶液处理。每个处理5 个重复，每盆种植10 株幼苗。自灌根处理后7 d 内每隔2 d 补充1 次培养液，7 d停止培养，取叶片测定每个处理的保护酶体系活性、脯氨酸（proline，Pro）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，每个重复取0.3 g 叶片于研钵，加入总体积为5 mL 的pH 7.8 磷酸缓冲液用液氮研磨成匀浆状后，置于超声清洗机内10 ℃以下超声提取1 min。提取液经4 ℃，8000 r·min-1离心15 min，上清液即为粗酶液，存于-20 ℃用于酶活性及MDA 含量分析。采用磺基水杨酸研磨提取液测定Pro 含量。

1.5 测定方法

萌发试验：测定发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数、株高和鲜重6 个指标。每个重复取10 株长势均一的幼苗测定株高；从5 个重复中随机取20 株测定总鲜重（数量不足的处理按一定比例缩小取样数量，称重后最终结果乘相应倍数），3 次重复。发芽相关指标则按以下公式计算：

式中：Gt表示发芽数，Dt表示天数；S表示株高均值。

pH 值和电导率测定：将腐解了0、2、3、7 和15 d 的紫云英腐解液过滤后置于烧杯中，使用pH 计和电导率计分别测定其中的酸碱度和电导率（electrical conductivity，EC）。

幼苗试验：采用NBT 还原法测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，比色法测定过氧化物酶（peroxidase，POD）活性，愈创木酚法测定过氧化氢酶（catalase，CAT）活性，TBA 法测定MDA 含量。取幼苗最后一片完全展开叶，采用DAB 染色法进行H2O2 组织原位定位分析，采用磺基水杨酸研磨提取，酸性茚三酮法测定脯氨酸（proline，Pro）含量［21］。

1.6 数据统计分析

计算不同腐解天数腐解液处理的各测定指标平均值，用其化感隶属值（respond index，RI）评价紫云英腐解物的化感效应。表示化感促进作用；RI<0，表示化感抑制作用；绝对值大小与化感作用强弱一致，计算各萌发指标的化感隶属值累加值，综合评价腐解物的化感效应［22］，在本研究中，RI 累加值达到-6 时，表明牛筋草的萌发和生长被完全抑制。

采用SPSS 24 对数据进行显著性分析，数据以平均值±标准差表示。采用GraphPad Prism 7 作图。

2 结果与分析

2.1 紫云英腐解液电导率及酸碱度变化

紫云英腐解液酸碱度随着腐解时间增加呈现下降趋势，以腐解2 d 时下降最快，腐解7~15 d 降幅较小。腐解液电导率在腐解2 d 时快速上升并达到最大值，随后5 d 时间内电导率下降，腐解7~15 d 电导率缓慢上升（图1）。

图1 不同腐解天数腐解液的电导率及酸碱度变化Fig. 1 The changes of electrical conductivity and pH of decomposed liquids in different decay days

2.2 紫云英腐解液对牛筋草种子萌发和幼苗生长的影响和综合评价

腐解时间≤3 d，浓度为2%，以及浓度为5%的2 d 腐解液对牛筋草种子发芽率表现为促进作用，浓度≥30%时表现为抑制作用。当腐解时间≥7 d 时，试验设计的各浓度腐解液均对牛筋草萌发起到抑制作用。腐解时间≥3 d，腐解液浓度为80%及腐解时间为15 d，腐解液浓度≥30%的处理下牛筋草发芽率为0。腐解2 d，浓度≤5%及腐解3 d，浓度为2%的紫云英腐解液对牛筋草发芽势表现为促进作用，当浓度升高时表现为抑制作用。当腐解时间≥7 d 时，试验设计的各浓度腐解液均对牛筋草发芽势起到抑制作用。腐解天数≥2 d，腐解液浓度为80%的处理条件下，牛筋草种子发芽势为0。腐解7 d 浓度≥30%及腐解15 d，浓度≥5%的处理组牛筋草种子发芽势为0。腐解时间≤3 d，浓度为2%，以及浓度为5%的2 d 腐解液能提高牛筋草种子发芽指数，其余浓度处理降低牛筋草种子发芽指数。当腐解时间≥7 d 时，试验设计的各浓度腐解液均对牛筋草发芽指数起到抑制作用，其中腐解≥7 d，浓度为30%的处理组发芽指数及腐解≥3 d，浓度为80%的处理组牛筋草发芽指数为0。腐解时间≤7 d 的腐解液在2%浓度条件下对牛筋草种子活力指数表现为促进作用，其中腐解天数为2 d 的腐解液在浓度为5%时可以显著提高牛筋草种子活力。腐解时间≥3 d，浓度≥5%及腐解时间为15 d 浓度≥2%的腐解液对牛筋草种子活力指数表现为抑制作用。腐解时间≥3 d，腐解液浓度为80%及腐解时间≥7 d，腐解液浓度≥30%的处理下，牛筋草种子活力为0（图2）。

图2 不同浓度及不同腐解天数腐解液对牛筋草种子萌发的影响Fig.2 Effects of different concentrations and different decay days decomposed liquids on the seeds germination of goosegrass

腐解时间≤7 d，浓度≤5%及腐解15 d 浓度为2%的腐解液对牛筋草株高表现为促进作用，此外，腐解时间为3 d，浓度为30%的腐解液对牛筋草幼苗株高表现为促进作用。4 个腐解时间段的80%腐解液以及7 d 和15 d浓度为30%的腐解液处理均能显著抑制牛筋草株高。腐解时间≤7 d，浓度≤5%，以及浓度为30%的3 d 腐解液能显著促进牛筋草鲜重的增加。腐解时间为3 d，浓度为80%、腐解时间为7 d，浓度≥30%以及腐解时间为15 d，浓度>5%的腐解液处理下牛筋草鲜重为0（15 d 腐解液处理下，浓度为5%和30%的处理组，平均分别只有2 株和1 株萌发，取样不具代表性，无法准确测定鲜重，故其结果记为0）（图3）。

图3 不同浓度及不同腐解天数腐解液对牛筋草幼苗生长的影响Fig.3 Effects of different concentrations and different decay days decomposed liquids on the seedling growth of goosegrass

结合表观生物学特征化感抑制效应分析，紫云英秸秆经过15 d 腐解产生的腐解液能显著抑制牛筋草萌发，但是对腐解时间小于7 d，浓度小于30%的腐解液处理下萌发的牛筋草株高抑制效应不明显（图4）。

图4 不同浓度及不同腐解天数腐解液对牛筋草萌发的影响效果Fig. 4 Effect of different concentrations and different decay days decomposed liquids on the germination of goosegrass

以化感作用隶属累加值作为紫云英对牛筋草化感作用的评价指标，腐解2 d 的低浓度（≤5%）腐解液及腐解3~7 d 浓度为2%的紫云英腐解液对牛筋草种子萌发和生长有促进作用，其余处理均不利于牛筋草萌发和生长，随着腐解天数和浓度的增加，腐解液对牛筋草的化感抑制作用增强（表1）。

表1 紫云英2~15 d 腐解液对牛筋草种子萌发和生长的综合评价Table 1 Comprehensive evaluation of 2-15 days decomposed liquids on seed germination and growth of goosegrass

2.3 紫云英15 d 腐解液对牛筋草幼苗生长的影响

不同浓度紫云英15 d 腐解液处理下，通过牛筋草幼苗鲜重数据可以发现，不同浓度梯度腐解液对牛筋草鲜重的增加具有显著抑制作用。相比CK，在含有腐解液的处理中，牛筋草根长也受到抑制，特别是80%浓度处理下的牛筋草，其根系较其他处理短且色深。通过观察叶色也不难看出，高浓度（≥30%）腐解液处理下的牛筋草叶子颜色相比其他处理较黄。综上，紫云英腐解液可以有效抑制牛筋草幼苗的生长（图5）。

图5 不同浓度15 d 腐解液对牛筋草幼苗的影响Fig. 5 Effects of different concentrations of 15 days decomposed liquid on goosegrass seedlings

2.4 紫云英15 d 腐解液对牛筋草幼苗保护酶活性、MDA 和Pro 含 量 的 影 响

牛筋草SOD 活性随着腐解液浓度升高而极显著下降（P<0.001）；POD 活性在低浓度（≤5%）腐解液处理条件下活性极显著下降，浓度>30%处理时活性提高，其中80%条件下达到极显著水平。CAT 活性在30%腐解液浓度内随着浓度升高而升高，2%浓度处理时活性提高不显著，5%和30%浓度条件下达到显著水平（分别为P<0.05 和P<0.01），当浓度达到80%时活性极显著下降。MDA 含量随着浓度的升高而升高，即使是在低浓度腐解液条件下，MDA 水平也极显著高于对照组。牛筋草植株Pro 含量随着腐解液浓度升高而升高，当腐解液浓度≥5%时，Pro 含量升高程度达显著水平（图6）。

图6 不同浓度15 d 腐解液对牛筋草幼苗SOD、POD、CAT 活性、MDA 及Pro 含量的影响Fig. 6 Effects of different concentrations of 15 days decomposed liquid on SOD，POD，CAT activity，MDA and Pro contents of goosegrass seedlings

2.5 牛筋草幼苗叶片H2O2的组织原位定位分析

腐解液浓度<5%时，牛筋草叶片不产生明显的褐斑，当浓度≥5%时，褐斑逐渐增多，当浓度≥30%时，叶尖处积累较多H2O2，经染色处理后在叶尖部的叶脉附近呈现黄褐色。80%浓度处理下牛筋草叶尖、叶中部及叶基部的H2O2含量均较其他浓度处理多。H2O2在牛筋草叶片不同部位聚集程度不同，叶尖较叶基部多，叶脉较叶肉多（图7）。

图7 牛筋草幼苗叶片不同部位H2O2定位Fig.7 Location of H2O2 in different parts of leaf of goosegrass seedlings

3 讨论

绿肥是一种全养分植物源肥料，合理使用绿肥不仅可以起到提高地力、改良土壤和保持水土的作用，还可以减少土传病害［23-24］、控制虫害发生［25］以及控制杂草生长［26］。植被覆盖可以减少除草剂的使用，增加土壤养分，是有机农业［27］、生态农业以及可持续农业的重要组成部分［28］。紫云英作为绿肥使用时常将地上部分粉碎后利用旋耕机翻压或铧式犁翻压，使其分布于表土下自然腐解。绿肥残枝落叶腐解或浸提液可以促进或者抑制其他植物的生长，这与提取过程中化感物质的合成与释放有关［22，29-30］。唐杉等［31］通过多年定位试验研究了紫云英还田对水稻（Oryza sativa）田种子库密度和多样性的影响，发现多年紫云英还田可以显著减少杂草种子库密度并显著提高了杂草种子库物种多样性及均匀度，这表明还田紫云英有控草的效果，同时，提高杂草种子库物种多样性及均匀度有利于稻田生态系统的稳定。通过4 个时间段腐解液处理综合评价可以看出，紫云英中含有对牛筋草种子萌发和生长存在抑制作用的物质，其含量随着腐解时间的增加而增加。低浓度短时间腐解的腐解液对牛筋草的生长表现为化感促进作用，这可能是腐解物中对牛筋草生长不利的化感物质含量较少，对牛筋草种子的伤害小或者是低浓度腐解液提高了相关酶活性。庄宇等［32］在研究棉花（Gossypiumspp）水浸提液对西瓜（Citrullus lanatus）、大豆（Glycine max）种子萌发与幼苗生长的影响也认为低浓度的浸提液可以显著促进供试植物的生长。

牛筋草对紫云英15 d 腐解液保护酶体系的响应各不相同，其中SOD 活性呈快速下降的趋势，且变化趋势在3个酶当中最大，这说明SOD 对腐解液敏感度最高。POD 活性在低浓度（≤5%）腐解液条件下先下降，当腐解液浓度升高到80%时活性显著高于对照组，POD 活性变化与萌发试验及幼苗试验牛筋草长势变化呈负相关，这说明POD 可能是牛筋草抵御紫云英腐解液中有害物质的关键酶。张金云［30］在研究山核桃（Carya cathayensis）外果皮化感物质对早熟禾（Poa annua）种子POD 活性的影响中也认为一些化合物浓度的提高会持续显著提高POD活性。CAT 在2%浓度腐解液处理下活性提高不显著（P>0.05），而在浓度提高时活性先增后减，说明CAT 能在一定程度上起到清除过氧化氢的作用，但是随着浓度的升高，CAT 活性极显著下降，表明高浓度腐解液可以抑制该酶活性，这与前人研究棉花浸提液对作物生长结论相似［32］。

植物器官组织在逆境下遭受伤害或衰老时，往往发生膜脂过氧化作用，生成过氧化脂质，后者逐渐分解为一系列复杂的化合物，其中包括MDA，积累MDA 对膜和细胞能造成伤害，其含量能用来反映植物受逆境伤害的程度［33］。试验牛筋草植株叶片MDA 含量随着腐解液浓度的升高而升高，即使是在低浓度腐解液条件下，MDA 水平也极显著高于对照组，这与牛欢欢［29］在研究光叶紫花苕子（Vicia angustifolia）对牧草的化感作用试验结论一致。这表明腐解液中存在的物质对牛筋草细胞脂膜具有氧化性，低浓度下腐解液对牛筋草的伤害较低，能促进牛筋草的生长，这可能是低浓度腐解液对牛筋草种子起到引发的作用，促进保护酶活性提高，起到炼苗的作用，因此总体上表现为促进作用。这与朱迎树等［34］研究引发对老化大麦（Hordeum vulgare）种子的影响结论相似。

当植物遭受渗透胁迫，造成生理性缺水时，植物体内脯氨酸大量累积。腐解液浓度为2%时对牛筋草幼苗脯氨酸含量影响不显著，可能是因为腐解液浓度低，没达到渗透胁迫所需浓度。当腐解液浓度大于5%时，随着腐解液浓度升高，牛筋草体内脯氨酸含量逐渐升高，这表明浓度大于5%的腐解液能对牛筋草造成胁迫，这与古龙［35］研究黄菊（Chrysanthemum morifolium）浸提液对单子叶杂草及油茶（Camellia oleifera）的化感作用的结论一致。从牛筋草叶片过氧化氢组织定位镜检图可以看出，高浓度的腐解液处理下牛筋草叶片过氧化氢含量明显增加，这可能是导致MDA 含量以及POD 活性提高的原因。

4 结论

通过利用紫云英腐解液对牛筋草种子及幼苗进行处理，发现腐解时间>3 d，浓度为80%及腐解时间为15 d浓度≥30%的腐解液可以完全抑制牛筋草的萌发。试验设计的4 个腐解时间和腐解浓度中，最适的紫云英腐解时间为15 d，最适的抑制牛筋草的腐解液浓度为80%。随着腐解液浓度的提高，腐解液对幼苗SOD 活性的抑制作用增强。低浓度（<30%）的腐解液会降低POD 活性，但会提高CAT 活性；相反，高浓度（80%）的腐解液会提高POD 活性，但会降低CAT 活性。紫云英腐解液可使牛筋草细胞脂膜发生氧化作用，对幼苗生长造成渗透胁迫。紫云英腐解液对牛筋草种子的萌发与幼苗的生长存在抑制作用，对牛筋草种子及幼苗生长的影响呈现“低促高抑”的规律，结果可为发掘紫云英中抗杂草活性物质提供参考。