鲜艳乳菇母种培养基的配方优化研究

郑 旋， 康 超， 王 晶， 曾维军， 王万坤， 杨彝华， 向 准

(贵州省生物研究所， 贵阳 550009)

鲜艳乳菇(Lactariusvividus)隶属于担子菌门(Basidiomycota)、伞菌纲(Agricomycetes)、红菇科(Russulaceae)、乳菇属(Lactarius)，在世界各地均有分布，是新发现的模式产地在中国的新物种，广泛分布于中国中部、西南及华南地区[1]。鲜艳乳菇为外生菌根真菌(ECM)，与松科、壳斗科等树种形成外生菌根[2]。其菌盖橙黄色，伤变蓝绿色，味道鲜美，含有丰富的蛋白质、氨基酸、多糖等营养成分[3]，市场上售卖的鲜艳乳菇主要依赖于野生子实体采集，随着生长环境受人为及自然因素影响，野生鲜艳乳菇数量逐年下降，鲜艳乳菇人工栽培成为发展趋势，而鲜艳乳菇菌种培养是发展人工栽培的基础[4]。赵辉等[5]采集达州地区鲜艳乳菇进行分离培养，徐彦军[6]研究了鲜艳乳菇在母种、原种及液体种培养基上的菌丝特性，结果均显示，由于培养基组成成分不同，对鲜艳乳菇菌丝生长产生不同影响。本研究采用单因素及正交试验法，对鲜艳乳菇在不同氮源、碳源、无机盐培养下的菌丝生长速度、菌丝萌发、菌丝形态等进行测定，通过优化母种培养基配方，促进菌丝萌发与生长，为鲜艳乳菇菌种培育和人工驯化栽培提供科学参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株：于2020年6月6日在贵州省龙里县市场收集的鲜艳乳菇子实体进行分离培养及鉴定保存。

试剂：蛋白胨、酵母浸粉、酵母浸膏、大豆蛋白胨、牛肉浸粉、牛肉浸膏、尿素、氯化铵、硫酸铵、草酸铵，葡萄糖、木糖、果糖、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉、蔗糖、半乳糖、甘露醇、糊精、KH2PO4、MgSO4、FeSO4、ZnSO4、CuSO4、MnSO4、CaCl2、NaCl、NaOH、HCl，以上试剂均为分析纯或生化试剂。

PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、纯净水1 000 mL。

蛋白胨麦芽糖培养基：大豆蛋白胨5 g、麦芽糖20 g、琼脂20 g、纯净水1 000 mL。

1.2 试验方法

1.2.1菌种活化

挑取保存的鲜艳乳菇试管菌株，接种到PDA培养基上进行活化培养，待菌丝生长20 d，备用。

1.2.2单因素试验

配置不同组成成分的试验培养基，挑取活化的鲜艳乳菇菌种块接种于不同培养基中央，每个处理重复3次，25 ℃恒温黑暗培养30 d，每隔5 d观测菌丝疏密度、长势，颜色、菌落直径、菌丝生长速度等指标。

氮源筛选：以葡萄糖20 g、琼脂20 g、纯净水1 000 mL为基础培养基，分别添加质量均为5 g的蛋白胨、酵母浸粉、酵母浸膏、大豆蛋白胨、牛肉浸粉、牛肉浸膏、尿素、氯化铵、硫酸铵、草酸铵，以该基础培养基作为对照组(ck1)。

组合氮源筛选：将筛选出的适宜氮源，酵母浸粉、大豆蛋白胨、牛肉浸粉，进行“两两组合”试验。在葡萄糖20 g、琼脂20 g、纯净水1 000 mL的基础培养基中，分别添加总质量为5 g的组合氮源，每个组合设置5个不同质量比，质量比分别为1∶9、3∶7、1∶1、7∶3、9∶1。

碳源筛选：以马铃薯200 g、琼脂20 g、纯净水1 000 mL为基础培养基，分别添加质量均为20 g的葡萄糖、木糖、果糖、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉、蔗糖、半乳糖、甘露醇、糊精，以该基础培养基作为(ck2)。

组合碳源筛选：将筛选出的适宜碳源，葡萄糖、麦芽糖、糊精，进行“两两组合”试验。在马铃薯200 g、琼脂20 g、纯净水1 000 mL的基础培养基中，分别添加总质量为5 g的组合氮源，每个组合设置5个不同质量比，质量比分别为1∶9、3∶7、1∶1、7∶3、9∶1。

无机盐单因素筛选：以大豆蛋白胨麦芽糖培养基为基础培养基，分别添加相同质量为0.5 g的KH2PO4、MgSO4、FeSO4、ZnSO4、CuSO4、MnSO4、CaCl2、NaCl，以该基础培养基作为(ck3)。

1.2.3正交优化试验

根据单因素筛选及组合复筛试验结果，以组合氮源、单一碳源、单一无机盐为主要影响因素，采用L9(34)正交表，设置酵母浸粉+牛肉浸粉(质量比=7∶3)，葡萄糖，CaCl2的3因素3水平正交试验，对培养基配方进一步优化(见表1)。

表1 L9(34)正交试验设计因素

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 不同氮源对鲜艳乳菇菌丝生长的影响

在鲜艳乳菇母种培养基中添加不同氮源对菌丝生长的影响如表2所示。不同氮源对菌丝直径与生长速度影响呈现显著差异性，以大豆蛋白胨为氮源培养基，菌丝生长速度最快，为2.35 mm/d，酵母浸粉次之，为1.52 mm/d，尿素和草酸铵培养下菌丝无生长。从萌发时间来看，在蛋白胨和大豆蛋白胨的氮源培养基，菌丝萌发时间最快，其次是酵母浸粉和酵母膏。从菌丝疏密度来看，以牛肉浸粉为氮源培养下，菌丝最密，其次是酵母浸粉和牛肉浸膏，而大豆蛋白胨培养下菌丝密度较稀。结合菌丝生长速度、萌发时间、菌丝疏密度和菌丝形态等指标，鲜艳乳菇菌丝生长的最优氮源为酵母浸粉和牛肉浸粉。

表2 不同氮源培养基上菌丝生长情况

2.2 不同氮源组合对鲜艳乳菇菌丝的影响

如图1、图2所示。在酵母浸粉与大豆蛋白胨组合中，当质量比为1∶9时菌丝生长速度最快，差异显著，但菌丝密度稀疏。在酵母浸粉与牛肉浸粉组合中，随着酵母浸粉的比重增加，菌丝生长速度基本呈向上趋势，当质量比为7∶3时菌丝生长速度最快，菌丝均较为致密。在大豆蛋白胨与牛肉浸粉组合中，当牛肉浸粉占比大时菌丝生长速度较慢，菌丝较密。考虑菌丝生长速度和菌丝密度，优选氮源组合为酵母浸粉与牛肉浸粉组合(质量比为7∶3)，即培养基中添加酵母浸粉3.5 g/L，牛肉浸粉1.5 g/L。

图1 不同氮源组合培养基上的菌丝生长速度

注：A组为酵母浸粉与大豆蛋白胨组合，B组为酵母浸粉与牛肉浸粉组合，C组为大豆蛋白胨与牛肉浸粉组合；其中数字1～5分别表示质量比为1∶9、3∶7、1∶1、7∶3、9∶1。图2 不同氮源组合培养基上的菌落形态

2.3 不同碳源对鲜艳乳菇菌丝生长的影响

在培养基中添加不同碳源对鲜艳乳菇菌丝生长的影响见表3所示。不同碳源对菌丝直径与生长速度影响呈显著差异性，以麦芽糖为碳源培养基，菌丝生长速度最快，为2.15 mm/d，其次是糊精和葡萄糖，木糖和半乳糖培养下菌丝未萌发生长。从萌发时间来看，在以麦芽糖、糊精和葡萄糖的培养基上菌丝萌发时间最快，其次是蔗糖和甘露醇。从菌丝疏密度来看，葡萄糖培养下菌丝密度最大，果糖次之。从菌丝形态来看，葡萄糖、果糖、甘露醇呈现针尖状，其他均呈现放射状。结合以上多个指标，鲜艳乳菇菌丝生长的最优碳源为葡萄糖。

表3 不同碳源对鲜艳乳菇菌丝生长的影响

2.4 不同碳源组合鲜艳乳菇菌丝生长的影响

不同碳源组合对鲜艳乳菇菌丝生长的影响见图3、图4所示。可以看出，随着质量比的变化，不同碳源组合培养下菌丝生长速度基本呈由快到慢再变快的趋势，在质量比为3∶7时菌丝生长速度均较慢。当麦芽糖和糊精的组合质量比为7∶3时，以及麦芽糖与葡萄糖的质量比也为7∶3时，菌丝生长速度相对较快，为1.91 mm/d和1.92 mm/d。但从落形态及菌丝疏密度来看，不同碳源组合培养基上菌落颜色较深，菌丝稀疏，贴附生长，鲜艳乳菇菌丝在单一碳源培养下优于组合碳源，故选用葡萄糖为单一碳源，不选择组合碳源。

图3 不同碳源组合培养基上的菌丝生长速度

注：a组为麦芽糖与糊精组合，b组为麦芽糖与葡萄糖组合，c组为糊精与葡萄糖组合；其中数字1～5分别表示质量比为1∶9、3∶7、1∶1、7∶3、9∶1。图4 不同碳源组合培养基上的菌落形态

2.5 不同无机盐对鲜艳乳菇菌丝生长的影响

在培养基中添加不同无机盐对鲜艳乳菇菌丝生长的影响，见图5所示。添加不同无机盐及对照组的菌落平均直径大小顺序为CaCl2>MgSO4>KH2PO4>ck>NaCl>FeSO4>CuSO4>MnSO4=ZnSO4，其中CaCl2对菌丝生长表现出显著促进作用，菌落直径为64.72 mm。其次，是在添加MgSO4培养下，菌落平均直径为55.02 mm，以及添加KH2PO4培养下，菌落平均直径为53.87 mm，但均与ck3数据无显著差异，而在添加MnSO4和ZnSO4的培养基上菌丝未萌发生长，故选择CaCl2作为鲜艳乳菇培养基中的无机盐。

注：不同小写字母表示在p<0.05水平下差异显著。图5 添加不同无机盐的培养基中的菌落直径

2.6 正交试验结果

L9(34)正交试验结果直观分析结果，从表4可以看出，3个试验因素对菌丝生长速度的影响为C>B>A。由表5可知，各因素之间无显著差异性。按照各因素的最优水平，C3B2A2水平组合为最优组合。结合Design-Expert软件分析，对C3B2A2组合进行验证。

表4 L9(34)正交试验结果及直观分析

表5 正交试验方差分析

验证结果为，C3B2A2培养基上菌丝生长速度为2.18 mm/d，与软件预测结果的2.21 mm/d数据相近，故选择C3B2A2为最优组合，即酵母浸粉3.5 g/L、牛肉浸粉1.5 g/L、葡萄糖20 g/L、CaCl21.5 g/L。

3 讨论与结论

本研究通过结合单因素及多因素组合试验，分析了不同因素对鲜艳乳菇菌丝生长速度、菌落直径、菌丝疏密度等的影响，筛选出适宜鲜艳乳菇菌丝生长的氮源、碳源和无机盐，采用正交试验对培养基进行优化，优选出鲜艳乳菇最适母种培养基配方。研究发现，在不同氮源中，酵母浸粉、牛肉浸粉和大豆蛋白胨对菌丝生长有较好的促进作用，尿素和草酸铵对菌丝生长产生明显抑制作用。其中大豆蛋白胨能显著促进菌丝快速生长，但菌丝密度低，牛肉浸粉能增强菌丝密度，但菌丝快速延生能力较弱，酵母浸粉在促进菌丝生长和增强菌丝密度两方面均处于中等效果，比较稳定。当酵母浸粉和牛肉浸粉的质量比为7∶3时，菌丝密度和生长速度达到较优水平，菌丝活力高。该研究结果与赵辉等[5]研究得到适宜氮源为酵母膏和蛋白胨，以及王冉等[7]研究得出添加酵母提取物的MYA为适宜培养基，在关于适宜氮源包含酵母的这一结论有一定相似。不同的是，本研究结果显示出酵母浸粉与牛肉浸粉(质量比7∶3)的组合氮源优于单一氮源，这可能是由于鲜艳乳菇菌丝能够较好地吸收不同来源的氮源营养物质，以供给自身生长。在不同碳源培养中，麦芽糖、糊精和葡萄糖对菌丝生长有较好的促进作用，木糖和半乳糖无法被菌丝吸收利用，其中葡萄糖能被菌丝较好吸收利用，菌丝较密，生长速度也较快，而通过不同碳源组合的试验效果不如单一碳源效果好，这可能是由于鲜艳乳菇菌丝在生长过程中对碳源具有相对选择性。研究结果与刘萍等[8]得出以马铃薯为碳源的结论有一定差异，而与赵辉等[5]研究得到适宜碳源为葡萄糖的结论相同。在不同无机盐中，CaCl2较其他无机盐对菌丝生长的促进作用最显著，但本研究中缺少了对不同无机盐不同添加量的试验设置，只选择了较为普遍的添加量，这可能不利于某些微量元素的影响判断，需要做进一步优化。本研究通过将筛选出的氮源、碳源、无机盐进行3因素3水平的正交试验，得到优化后的培养基配方为酵母浸粉3.5 g/L、牛肉浸粉1.5 g/L、葡萄糖20 g/L、CaCl21.5 g/L，琼脂18～20 g/L。后期将尝试研究更多其他因素对鲜艳乳菇菌丝生长的影响，以及液体菌种培养基的研究，为鲜艳乳菇菌种培育、保存和开发利用提供科学依据。