电针预处理对大鼠离体心肌缺血再灌注心肌组织自噬的调控作用

尹 侠，李宏玉,，朱路文，唐 强

(1. 黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2. 黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001)

冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)是冠状动脉发生粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病，是人类健康面临的巨大挑战[1-2]。目前，经皮冠状动脉血管成形术(PCI)、冠状动脉旁路移植术是治疗冠心病的主要手术方法[3-4]，虽然这些干预措施提高了患者的存活率，但恢复血流灌注的过程诱导了心肌内的各种病理变化，这种现象被称为心肌缺血再灌注损伤[5]。近年来研究证实，自噬在缺血再灌注损伤中有重要作用，针刺可以通过调节细胞自噬来保护心肌组织[6-8]。本实验通过建立离体心肌缺血再灌注损伤动物模型，观察自噬标志蛋白 Beclin-1和LC3-Ⅱ的变化，探讨了电针预处理对缺血再灌注心肌的保护作用机制，以为临床应用提供更多参考。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 健康雄性SPF级成年Sprague-Dawley大鼠36只，体重240～260 g，由黑龙江中医药大学动物实验中心提供，许可证号：SYXK(黑)2020002。大鼠喂养于黑龙江中医药大学脑功能与神经康复实验室，饲养条件：温度(22±2)℃，湿度(55±5)%，自由饮食和摄水，12 h光照/12 h黑暗。本研究严格遵守国家爱护和使用实验动物研究的相关规定，动物实验经黑龙江中医药大学伦理委员会批准。

1.2主要仪器 Langendorff离体心脏灌流实验系统，江苏赛昂斯生物技术有限公司；-80 ℃超低温冰箱，日本Panasonic公司；华佗牌SDZ-Ⅱ型电针治疗仪，苏州医疗用品有限公司；WB凝胶成像系统，BIO-RAD公司；一次性无菌针灸针，北京汉医医疗器械中心。

1.3主要试剂 肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒，上海碧云天物技术公司；肝素钠注射液，天津生物化学制药有限公司，规格：1万IU/mL；BCA蛋白定量试剂盒、蛋白裂解液，上海Beyotine Biotechnology公司；Beclin-1和LC3-Ⅱ抗体，武汉三鹰生物技术有限公司。

1.4实验方法

1.4.1分组及预处理方法 大鼠适应性饲养1周后，按照随机数字表法分为正常组、缺血再灌注组和电针预处理组，每组12只。电针预处理组：参照《实验针灸学》[9]，结合动物比较解剖学方法定位取双侧心俞穴和神门穴，双侧心俞穴位于双侧“内关”第五胸椎棘突下、双侧各旁开约7 mm处，针刺深度约5 mm；双侧“神门”位于前肢内侧腕部横纹尺骨边缘处，针刺深度约2 mm。连接华佗牌SDZ-Ⅱ型电针仪，取两侧心俞接负极，并在各侧穴位下方2 mm刺一针作为参考电极接正极，取两侧神门穴接负极、大鼠尾部接正极。电针参数：频率2 Hz，电压3 V，选取连续波。电针处理20 min/次，1次/d，6 d/周，连续干预3周。正常组和缺血再灌注组在电针预处理组干预的3周内自由饲养。

1.4.2Krebs-Henseleit(K-H)营养液配制方法取13.79 g氯化钠、0.70 g氯化钾、0.33 g磷酸二氢钾、0.51 g硫酸镁、4.36 g葡萄糖、4.20 g碳酸氢钠，用1 000 mL蒸馏水混匀，待完全溶解后通入95%氧气、5%二氧化碳混合气体30 min，用浓盐酸调节pH值至7.4；最后加入0.61 g氯化钙，待其完全溶解后，加入1 000 mL蒸馏水定容、过滤，防止产生沉淀。K-H营养液现配现用。

1.4.3模型制备方法 以戊巴比妥钠溶液40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，15 min后注射抗凝液100 IU/100 g抗凝，待大鼠完全麻醉后剖胸，剪断主动脉，心脏离体后立即放在4 ℃ K-H营养液中，用手指轻轻反复按压心脏，挤出心脏内残余的血液，迅速将心脏悬挂于已调试好的离体灌流装置上，在肺动脉剪口使冠状动脉灌流液顺利排出，保持体外循环完整通畅。缺血再灌注组和电针预处理组大鼠平衡灌注20 min,缺血40 min，再灌注2 h；正常组无缺血再灌注操作，全程平衡灌注180 min。

1.5检测指标及方法

1.5.1灌流液内CK、CK-MB、LDH含量 各组大鼠停灌注前20 min取2 mL灌流液，-80 ℃保存，按照检测试剂盒说明书，采用ELISA法检测灌流液中CK、CK-MB、LDH含量。

1.5.2心肌组织病理形态 灌流结束后，取心肌组织，置于4%多聚甲醛溶液中固定24～48 h,常规脱水、石蜡包埋，切片厚度为4 μm,于45 ℃左右温水中展片后，捞至玻片上铺正，65 ℃烤片10 min,65 ℃烘片2 h；二甲苯脱蜡，乙醇梯度水化，苏木精液染色8 min；水洗，1%盐酸乙醇分化2 s；水洗，水中浸泡反蓝10 min，乙醇处理后，酸化伊红溶液染色2 min；乙醇脱水，二甲苯透明；中性树胶封固树脂胶封片，光镜下观察，照相。

1.5.3心肌组织超微结构 切取约1 mm×1 mm×1 mm大小心肌组织，2.5%戊二醛磷酸缓冲液4 ℃固定24～48 h；漂洗、梯度丙酮脱水、浸透、包埋、切片(厚度50～70 nm)、染色,透射电镜观察心肌纤维、心肌细胞内自噬小体和自噬溶酶体等结构。

1.5.4心肌组织中Beclin-1和LC3-Ⅱ表达情况采用Western blot法检测：剪取各组大鼠心肌相同部位组织，加入适量预冷的PBS缓冲液对心肌组织进行反复冲洗。每0.1 g组织加入1 mL裂解液，低温匀浆、离心,取上清,BCA法进行蛋白定量,制备分离胶、浓缩胶,上样,100 V恒压电泳，200 mA恒流进行转膜，浸于用TBST制作的5%脱脂奶封闭液中，在室温条件下封闭1 h，一抗孵育过夜，弃掉一抗稀释液，用TBST缓冲液冲洗10 min，重复洗4次,然后在室温条件下加入Beclin-1和LC3二抗稀释液(1∶5000稀释于含5%脱脂奶粉的TBST中)孵育1 h。弃掉二抗稀释液，将膜浸在TBST中冲洗10 min，重复洗4次。ECL反应显色、曝光成像，用凝胶处理系统进行灰度值计算并分析。

2 结 果

2.1各组大鼠灌流液中CK、CK-MB、LDH含量比较 缺血再灌注组灌流液中CK、CK-MB、LDH含量均显著高于正常组(P均<0.05)，电针预处理组均显著低于缺血再灌注组(P均<0.05)。见表1。

表1 正常组和缺血再灌注各组大鼠冠状动脉灌流液中CK、CK-MB、LDH 含量比较

2.2各组大鼠心肌组织HE染色表现 正常组大鼠心肌纤维排列整齐，无断裂；缺血再灌注组大鼠心肌纤维出现溶解、断裂，甚至坏死，细胞间质扩大，细胞肿胀，外膜破损、断裂成絮状或缺失；电针预处理组大鼠心肌纤维间隙轻度增宽，偶见坏死灶，细胞轻微肿胀，细胞核及细胞界限结构基本完整。见图1。

图1 正常组和缺血再灌注各组大鼠心肌组织HE染色表现(×400)

2.3各组大鼠心肌组织透射电镜下表现 正常组大鼠心肌组织中线粒体排列、形态和数量正常，线粒体嵴清晰、排列整齐；缺血再灌注组大鼠心肌组织中部分线粒体固缩变小、颜色加深，部分线粒体肿胀、或外膜破损、或成空泡样病变，线粒体嵴不规则、断裂成絮状，自噬溶酶体数量显著增加(箭头所指)；电针预处理组大鼠心肌细胞核结构基本完整，排列稍紊乱，部分线粒体水肿，自噬溶酶体数量较缺血再灌注组少。见图2。

图2 正常组和缺血再灌注各组大鼠心肌组织透射电镜下表现(×5 000)

2.4各组大鼠心肌组织中Beclin-1和LC3-Ⅱ表达情况 缺血再灌注组心肌组织中Beclin-1和LC3-Ⅱ表达量均显著高于正常组(P均<0.05)，电针预处理组均显著低于缺血再灌注组(P均<0.05)。见图3及图4。

图3 正常组和缺血再灌注各组大鼠心肌组织中Beclin-1和LC3-Ⅱ表达条带

图4 正常组和缺血再灌注各组大鼠心肌组织中Beclin-1和LC3-Ⅱ相对表达量

3 讨 论

缺血预适应这一概念最早由Murry等[10]提出，其与中医“治未病”思想相一致，为治疗缺血性心脏病提供了新的治疗思路。早在张仲景的《伤寒论》中就有提及“针刺治未病”的思想，电针预处理属于“针刺治未病”的范畴，目的都在于“未病先防”。相关研究证实，针刺可以激发体内的内源性保护机制，相对于其他药物处理其不良反应较少，不会对组织器官造成损伤[11]。目前，电针预处理常用于实验动物缺血再灌注模型研究中，具有明确显著的心肌保护效应[12-14]。本实验根据“俞原配穴”的原则，选取心俞穴和神门穴配伍的电针预处理方案来观察电针预处理对缺血再灌注损伤自噬的调控作用。

心肌酶主要指心肌细胞内的酶类物质,心肌细胞坏死时可释放出多种心肌酶，心肌酶活性升高的程度可反映心肌损害的程度[15]。其中CK、CK-MB为特异性心肌酶，LDH为糖酵解酶，这些指标可反映早期心肌受损情况。本实验结果显示，缺血再灌注组大鼠灌洗液中CK、CK-MB、LDH含量明显升高，病理观察显示心肌组织受损，证实缺血再灌注可造成心肌损伤；电针预处理组大鼠灌洗液中CK、CK-MB、LDH含量均明显低于缺血再灌注组，病理观察显示心肌组织损伤减轻，提示电针心俞穴和神门穴预处理对心肌细胞具有明显的保护作用。这一结果与张小蕾等[16]和石力等[17]研究结果一致。

自噬是细胞内部“自我消化”“自我保护”的一个过程，但在缺血再灌注损伤的病理过程中，自噬可能是一把双刃剑，适度的自噬激活可保护心肌细胞，但过度的自噬激活，最终会引起细胞自噬性凋亡[18-20]。LC3是自噬体膜上的标志性蛋白，细胞内有2种形式，即LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ，自噬小体形成后，LC3-Ⅰ与磷脂酰乙醇胺耦联形成LC3-Ⅱ，其具有膜定位能力，定位于自噬体内膜和外膜。由于LC3-Ⅱ在自噬体膜上保持稳定，所以被用作自噬体标记物，其表达量在一定程度上反映了自噬体个数。Beclin-1是调节细胞自噬的关键基因，在自噬启动过程中具有重要的调控作用[21]。有研究表明，心肌缺血再灌注后，Beclin-1蛋白表达量显著增高[22]。本实验结果显示，缺血再灌注组大鼠心肌组织中Beclin-1、LC3-Ⅱ表达量明显增高，说明恢复再灌注后自噬过度激活；电针预处理组大鼠心肌组织中 Beclin-1、LC3-Ⅱ表达量明显低于缺血再灌注组，说明电针预处理能够调控细胞自噬能力，从而发挥心肌保护作用。

综上所述，电针作为一种良性刺激，能够增加大鼠心肌缺血耐受性，可以调控缺血再灌注后相关自噬蛋白的表达，对缺血再灌注心肌组织产生保护效应。但本实验没有对自噬发生的具体通路机制做进一步探讨，还有待后续研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。