基于丝素蛋白微球的可注射胶体凝胶的制备

钱坤煜, 薛敬哲, 陈 胜, 陆 杨

(合肥工业大学 化学与化工学院,安徽 合肥 230009)

由生物高分子制备的微球是一种可负载药物和实现药物缓释的载体[1-2]。丝素蛋白提取自桑蚕蚕茧,与其他材料相比具有炎症反应低、生物相容性好[3]、机械性能优越等优点[4]。基于丝素蛋白制备的微球可以高效地负载生物活性分子,已经广泛用于药物缓释[5]、酶固定化[6]等领域。丝素蛋白微球(silk fibroin microspheres,SFMs)的合成方法主要有乳化法[7]、自组装法[8]、微流控技术[9]等。与其他合成方法相比,乳化法装置较简单,无需有毒溶剂,且有利于保持所负载生物分子的活性。在最近的报道中,丝素蛋白水溶液可以在聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)乳化作用下快速形成微球,并实现微球尺寸的调控[7]。但是该乳化法得到的产物粒径较大,基于该方法进行改进优化有望实现较小尺寸的丝素蛋白微球的可控制备。

水凝胶目前是一种受到广泛关注的生物材料,已经广泛应用于组织工程、肿瘤治疗等生物医学领域。丝素蛋白可以通过升温、调节pH值、加入化学交联剂等方法制备成水凝胶,但是所制备凝胶的注射性较差[3]。与常规的聚合物凝胶相比,胶体凝胶是一种具有优异的可注射性的生物材料,具有良好的黏弹性。胶体凝胶是由分散的胶体粒子组成的,胶体粒子之间通过可逆的、非共价交联的作用力自组装形成非均相微粒网络。功能性的微纳米粒子作为构筑单元可以制备出具有多种功能性的可注射性胶体凝胶[10],为丝素蛋白凝胶的制备提供新方案。本文基于前期对胶体凝胶和丝素蛋白的研究,使用PEG乳化后再冷冻的改进方法,并通过调节PEG和丝素蛋白的质量浓度实现了250～400 nm尺寸的丝素蛋白微球的制备。进一步通过与带有相反电荷的明胶粒子在中性pH值条件下混合,利用静电作用力交联形成具有优异的可注射性的丝素蛋白胶体凝胶。

1 实验部分

1.1 主要试剂与仪器

无水碳酸钠购自国药集团;溴化锂,聚乙二醇(20、10、4 kDa)购自Aladdin。

采用卡尔蔡司Merlin Compact场发射扫描电子显微镜(field emission scanning electron microscope,FESEM)分析样品的形貌结构;采用马尔文ZS90型Zeta电位仪进行电位分析;采用Instron5695型万能力学试验机进行注射性评价。

1.2 实验过程

1.2.1 丝素蛋白溶液的制备

无水碳酸钠对蚕茧脱胶处理后,使用溴化锂溶液(9.3 mol/L)溶解干燥的蚕丝,并通过去离子水透析除杂获得丝素蛋白水溶液。微球的合成需要质量浓度为120 g/L的丝素蛋白溶液,因此需要将上述丝素蛋白溶液装入透析袋(分子量3 500),在PEG溶液(10 kDa,100 g/L)中透析浓缩。透析袋内丝素蛋白溶液体积减少至1/2左右时取出,即获得高质量浓度的丝素蛋白溶液。丝素蛋白溶液在4 ℃ 冰箱中保存,并利用干燥称重法测定准确质量浓度。

1.2.2 丝素蛋白微球的可控制备

采用改进的PEG乳化法制备丝素蛋白微球。取 2 mL一定质量浓度的丝素蛋白溶液放置在磁力搅拌器上,缓慢搅拌(100 r/min)的同时滴加等体积的PEG溶液进行乳化。混合后再搅拌30 s左右,待其充分混匀后放入冰箱冷冻室处理48 h。冷冻处理结束后,将小玻璃瓶取出在室温下解冻,并离心洗涤3次即可获得丝素蛋白微球。研究PEG溶液质量浓度对丝素蛋白的调控时,丝素蛋白溶液质量浓度为60 g/L,PEG分子量为10 kDa,分别配制质量浓度为200、300、500 g/L的3组PEG溶液进行合成。研究丝素蛋白溶液质量浓度对丝素蛋白微球的调控时,PEG分子量为10 kDa,质量浓度为300 g/L,分别使用质量浓度为20、60、80、120 g/L的4组丝素蛋白溶液进行合成。通过FESEM对各组微球的形貌和尺寸进行观察。

1.2.3 丝素蛋白微球明胶粒子胶体凝胶的合成

根据文献[11]报道的两步去溶剂法制备明胶粒子。分别称取一定量的丝素蛋白微球冻干粉末和明胶粒子冻干粉末,分散在去离子水中配制成质量浓度为100、150、200 g/L的水溶液。使用Malvern Zetasizer Nano ZS90 Zeta电位分析仪对不同pH值下丝素蛋白微球和明胶粒子水溶液的Zeta电位进行测试。将1 mL上述制备的丝素蛋白微球溶液与等体积、等质量浓度的明胶粒子溶液混合,使用涡旋混合机充分混匀即获得胶体凝胶。使用万能力学实验机搭载自制支架对丝素蛋白微球明胶粒子胶体凝胶的可注射性进行定量测试[12]。将合成好的胶体凝胶放在冷冻干燥机(Labconco, FreeZone6)中冻干,通过场发射扫描电子显微镜对冻干的样品微观形貌进行观察。

2 结果与讨论

2.1 丝素蛋白微球的调控和形貌表征

2.1.1 PEG质量浓度对丝素蛋白微球的调控

在乳化法制备丝蛋白微球的过程中,PEG溶液可以作为乳化剂。当PEG溶液滴入缓慢搅拌的丝素蛋白溶液中时,溶液会逐渐变白,即乳化的过程。当丝素蛋白溶液质量浓度为60 g/L,冷冻处理的时间为48 h,PEG分子量为10 kDa时,不同PEG溶液质量浓度下所得的产物的FESEM图像如图1所示。

由图1可知，当PEG溶液质量浓度较低时(200 g/L)制备出的是粘连的凝胶;当PEG溶液质量浓度达到300 g/L时,逐渐开始形成微球,尺寸为400～600 nm。但是球与球中间存在一些丝状物粘连,可能是由于乳化不够彻底;当PEG溶液质量浓度达到500 g/L时,合成的微球尺寸较小,为250～400 nm,且大小比较均匀。由上述实验结果可以得出如下结论:在一定的质量浓度范围内,PEG溶液的质量浓度越高,乳化的效果越好,有利于形成微球;PEG质量浓度太低则无法获得单分散的微球结构。在进一步研究丝素蛋白溶液质量浓度对微球形貌和尺寸的影响时,选择PEG溶液的质量浓度为500 g/L。

图1 不同PEG溶液质量浓度下合成的丝素蛋白微球的FESEM图像

2.1.2 丝素蛋白质量浓度对丝素蛋白微球的调控

不同丝素蛋白溶液质量浓度下，合成的丝素蛋白微球的FESEM图像如图2所示。

图2 不同溶液质量浓度下合成的丝素蛋白微球的FESEM图像

作为微球生长合成过程中的前驱体溶液,丝素蛋白溶液的质量浓度对合成的微球形貌与尺寸有明显影响。

当研究丝素蛋白质量浓度的影响时,选取的PEG(10 kDa)溶液的质量浓度为500 g/L,冷冻处理的时间为48 h。当丝素蛋白溶液质量浓度较低时(20 g/L),无法使丝素蛋白溶液形成微球(图2a),此时形成的是相互交联的丝素蛋白网络;当质量浓度达到60 g/L时,形成单分散的丝素蛋白微球(图2b),尺寸为250 ～ 400 nm;当丝素蛋白溶液质量浓度达到80 g/L时,微球的尺寸逐渐开始变大(图2c),大部分丝素蛋白微球的尺寸为500～800 nm;当丝素蛋白的质量浓度达到120 g/L时,所合成的微球尺寸已经达到微米级(图2d),为1 ～ 2 μm,且表面较光滑,但是尺寸分布非常不均匀。

由上述实验结果可以得出如下结论:丝素蛋白质量浓度过低时无法形成微球,而随着丝素蛋白溶液质量浓度的增加,乳化效果更好,所合成的微球的尺寸显著增加,表面也更加光滑。

2.2 丝素蛋白微球和明胶粒子的电位分析

当2种带电粒子带有相反的电荷时,在合适的条件下进行混合，可以在静电作用力下形成稳定的胶体凝胶。不同pH值条件下粒子的表面电荷会发生改变,在pH值为5～10的范围内丝素蛋白微球和明胶粒子的Zeta电位值结果如图3所示。由图3可知，丝素蛋白微球(图1c中所制备的250～400 nm SFMs)在pH值为6～10的范围内带有较强的负电荷;明胶粒子在pH值为9～10之间发生了电位翻转,由负电荷转变成正电荷,且电位值随着pH值的下降显著增长。在溶液pH值为5 ～ 9的范围内,丝素蛋白微球和明胶粒子带有相反的电荷。

图3 不同pH值下丝素蛋白微球和明胶粒子的Zeta电位值

2.3 丝素蛋白微球明胶粒子胶体凝胶的合成

基于对丝素蛋白微球和明胶2种粒子Zeta电位的测量,并且考虑到所制备的凝胶的生物用途,选择在中性pH值条件下将分别带相反电荷的2种粒子混合。此时,丝素蛋白微球表面为负电荷,明胶粒子所带的是正电荷,2种粒子在静电作用力下可以形成稳定的颗粒凝胶网络。其合成过程如图4所示,需将2种粒子的水溶液涡旋混匀,最终形成凝胶。

丝素蛋白微球-明胶粒子胶体凝胶合成实物及其FESEM图像如图5所示。

由图5a可以看出，当2种粒子水溶液刚混合时,此时由于2种胶体粒子还没有混合均匀,仍具有流动性。

混合溶液经过涡旋均匀之后所合成的产物如图5b、图5c所示,从图5b、图5c可以看出，倒置或者斜置时能长时间保持形态,明显失去了流动性,从而证明已经成功制备出胶体凝胶。

冻干凝胶在FESEM下的微观形貌如图5d所示,由图5d可知凝胶结构是由胶体粒子交联形成的。

图4 丝素蛋白微球-明胶粒子胶体凝胶合成过程

图5 丝素蛋白微球-明胶粒子胶体凝胶合成实物和FESEM图像

2.4 胶体凝胶的注射性评价

丝素蛋白微球-明胶粒子胶体凝胶的注射性评价结果如图6所示。

图6c～图6e所示为粒子凝胶制备时，固体颗粒在水溶液中质量浓度分别为100、150、200 g/L的注射率-荷载关系。因为由微球和明胶粒子组成的胶体凝胶相对于传统的聚合物网络凝胶体系具有显著的剪切变稀的优势(图6a),所以该丝蛋白胶体凝胶可以从注射器中推注出来,即具有良好的可注射性(图6b)。

为了进行定量表征,将丝蛋白胶体凝胶移入1 mL注射器中,然后将注射器固定在自制的载样支架上。注射器的上端紧贴在Instron万能力学试验机的上压盘,确保启动压缩模式测试时凝胶可以从注射器中被匀速挤压出,并测试挤出过程中的压力,可以反馈胶体凝胶的注射过程。100、150、200 g/L 3个质量浓度的胶体凝胶从注射器中全部挤出前所需要施加的注射力基本保持恒定,未出现显著的相分离和堵塞(图6c～图6e),都表现出良好的可注射性。

图6 丝素蛋白微球-明胶粒子胶体凝胶的注射性评价

3 结 论

本文采用改良的PEG乳化法合成了一系列不同尺寸的丝素蛋白微球。FESEM表征结果表明,通过调节丝素蛋白溶液质量浓度和PEG溶液质量浓度可以实现对丝素蛋白微球形貌与尺寸可控合成。制备小尺寸的丝素蛋白微球的优化合成条件为60 g/L的丝素蛋白溶液质量浓度和500 g/L的PEG(10 kDa)溶液质量浓度,冷冻处理的时间为48 h。在中性pH值溶液中带有正电荷的明胶粒子和带有负电荷的丝素蛋白溶液混合均匀后通过静电作用力形成可注射的胶体凝胶。

同时,丝素蛋白和明胶都是良好的药物载体,在构筑单元胶体粒子上通过物理吸附[10]负载抗肿瘤药物,可以制备出载药的胶体凝胶。因为具有良好的可注射性和体系可扩展性,所以该粒子凝胶有望用于肿瘤微环境的响应性药物释放。