微生物发酵法脱除胭脂萝卜红色素异味的工艺优化

阳晖，陈明月，龚乃霞，曹沁倩，张川雨，李昌满

长江师范学院现代农业与生物工程学院（重庆 408100）

萝卜红色素是一种天然色素。它具有安全、无毒的特点，同时还兼具一定的营养价值和药理作用[1]。但是由于萝卜在咀嚼或加工过程中内源酶水解硫代葡萄糖苷产生异味，因此现有工艺制备的萝卜红色素常带有异味[2-3]。这种异味成为限制其在食品工业中应用的主要因素，研究萝卜红色素的高效脱异味技术迫在眉睫[4]。

基于上述难点，各国研究者对萝卜红色素的脱臭工艺进行深入研究。陈亚平等[5]经过酸、酶制剂、稳定剂、调节剂和树脂处理等过程制得一种产率高、色素保留完全的脱味萝卜红色素。陈文田等[6-7]采用酸化有机介质法高效地去除萝卜色素中的异味。汤川千代树等[8]研发一种特殊的专用脱臭技术进行除味来获得可以进行商业化生产的脱味萝卜红色素。Rodriguez- Saona等[9]采用一种特殊的设备成功地吸附了萝卜色素中的异味。除上述方法外，去除异味的方法还包括超临界二氧化碳萃取法[10-12]、吸附法[13-16]、酶解法[17-19]、沉淀法[20]和膜分离法[21-22]等。但这些方法都存在一些不足。如理化脱味法脱味范围都较小，脱味率低，脱味后会影响萝卜红色素的提取率和稳定性，脱臭效果并不理想。而生物学脱味法可分为酶解法和微生物脱味法，但添加酶制剂成本较高，且不能从根本上脱除异味[23-24]。微生物脱异味效果较好，还有具有操作简单、成本低廉、不污染环境等优点，是脱除萝卜色素异味的理想选择[25]。

试验选取果酒酵母为发酵菌种，对胭脂萝卜红色素中异味进行脱除，并优化脱味工艺，以期获得一种脱味效果好、色价高、可用于工业化生产的脱除萝卜红色素异味的工艺，为扩大萝卜红色素的适用范围奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

胭脂萝卜（涪陵农贸市场）；葡萄酒、果酒专用酵母RW（安琪酵母股份有限公司）；柠檬酸、浓盐酸（潍坊英轩实业有限公司）；酒石酸（食品级，滕州市香凝生物工程有限责任公司）；乙酸钠（重庆傅艺化学试剂有限公司）；氯化钾（成都市科龙化工试剂）。

CX-12000组织破碎机（东莞市南城长协电子制品厂）；H30FK802-136高压灭菌锅（东莞市星辰电器贸易有限公司）；ZWY-2102C恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）；SB-4200 DTD超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；RV 10 B S25真空旋转蒸发仪（广州市深华生物技术有限公司）；CS101-2ABN电热鼓风干燥箱（重庆市永生实验仪器厂）；ZD-F20真空冷冻干燥器（南京载智自动化设备有限公司）；PHS-3C pH计（上海虹益仪器仪表有限公司）；V-1800可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 脱臭萝卜红色素制取的工艺流程

1.2.2 操作要点

1.2.2.1 匀浆

将胭脂萝卜丁、蒸馏水按料液比1∶1（W/W）进行匀浆，备用。

1.2.2.2 调pH、灭菌

用5%柠檬酸将萝卜匀浆调节pH后，在121 ℃，灭菌30 min。

1.2.2.3 制备菌悬液、接种、发酵

将果酒酵母菌粉和加入10倍无菌水混匀，在30 ℃，活化10～20 min，制备成菌悬液。按一定接种量接种加入到胭脂萝卜发酵液中，在转速160 r/min摇床中发酵。

1.2.2.4 超声提取

在超声温度30 ℃、超声时间40 min、超声功率400 W条件下进行萝卜红色素提取[26]。

1.2.2.5 测定红色素含量

在最大吸收波长530 nm处测定萝卜红色素的含量[27]。

1.2.2.6 旋蒸、冻干

将萝卜红色素提取液在转速120 r/min、温度35 ℃条件下进行旋转蒸发，浓缩至黏稠。将浓缩液进行真空冷冻干燥至恒重，得到脱臭型萝卜红色素。

1.2.3 单因素试验

固定酵母菌的接种量1%、初始pH 4.5、发酵温度26 ℃、发酵时间36 h，考察发酵时间（12，24，36，48和60 h）、发酵液初始 pH（3.5，4.0，4.5，5.0和5.5）、发酵温度（22，24，26，28和30 ℃）以及酵母菌的接种量（0.6%，0.8%，1.0%，1.2%和1.4%）对胭脂萝卜红色素异味和红色素提取量的影响。

1.2.4 响应面试验

根据单因素试验的结果，选取接种量、发酵时间、发酵温度、发酵pH对萝卜红色素有重要影响的因素，以感官评分为响应值，采用Design Expert 12软件设计响应面试验，优化脱除胭脂萝卜红色素异味的工艺。响应面设计的水平因素见表1。

表1 响应面试验水平因素表

1.2.5 质量指标测定

1.2.5.1 感官评价

由20名食品专业学生按照表2进行感官评价。

表2 萝卜红色素异味的感官评分标准

根据张梓涵等[27]的方法，对萝卜红色素的提取量进行测定。量取20 mL萝卜发酵液B，平均分成2份，分别用pH 1.0和pH 4.5的缓冲液（pH 1缓冲液：称取1.86 g氯化钾、980 mL蒸馏水，搅拌均匀，用浓盐酸进行pH矫正；pH 4.5缓冲液：称取32.82 g乙酸铵、960 mL蒸馏水，搅拌均匀，用浓盐酸进行pH矫正）定容至50 mL，静置后在最大吸收波长530 nm处测定其吸光度，根据公式计算其色素提取量并进行比较。计算方式见式（1）。

式中：C为色素提取量，mg/g；A0是pH 1.0时色素在530 nm处的吸光度；A1是pH 4.5时色素在530 nm处的吸光度；V为提取液总体积，mL；n为稀释倍数；M为天竺葵素的相对分子量，取值648.5；ε为消光系数，取值30 200）；m为胭脂萝卜的质量，g。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 发酵温度对胭脂萝卜红色素异味和提取量的影响

如图1所示，发酵温度极大地影响脱异味的效果。这是由于萝卜红色素的主要异味物质来源是萝卜中硫代葡萄糖苷化合物的分解代谢产物，如3-丁烯-1-异硫氰酸酯、3-（甲硫基）-丙基异硫氰酸酯和4-（甲硫基）-3-丁烯基异硫氰酸酯等[28]。在适宜的发酵温度范围内，酵母菌在代谢过程中，减少了这些异味物质的产生，因此降低了萝卜红色素中的异味。随着温度逐渐升高，萝卜红色素的异味呈先减少后增加趋势，发酵温度26 ℃时，感官评价分数最高。在一定范围内，发酵温度对萝卜红色素提取率的影响不大（P＜0.05）。发酵温度为24 ℃时，萝卜红色素的提取量最高，为0.026 mg/g。仅比对照组相差0.000 4 mg/g。综上所述，从资源利用度方面综合考虑，选择温度24，26和28 ℃进行响应面优化试验。

图1 发酵温度对胭脂萝卜红色素异味和红色素提取量影响

2.1.2 发酵时间对胭脂萝卜红色素异味和提取量的影响

如图2所示，发酵时间12 h时，红色素提取量比对照组的提取量略有增加，为0.028 8 mg/g，其原因是在这个阶段处于发酵的初始阶段，不但不会引起红色素的降解，反而有利于红色素从萝卜细胞中的溶出。发酵时间36 h时，感官评分达到最高值，为7.5分。发酵时间超过36 h，感官评分逐渐降低，发酵液中出现新异味，这可能是酵母过度发酵，产生新的发酵产物所致。另外，低糖浓度及其降解副产物会降低花青素稳定性，并形成棕色聚合物；高糖浓度可能会降低水分活性，从而对花青素的活性有保护作用[29]。综上所述，选择发酵时间24，36和48 h进行响应面优化试验。

图2 发酵时间对胭脂萝卜红色素异味和红色素提取量的影响

2.1.3 发酵液初始pH对胭脂萝卜红色素异味和提取量的影响

如图3所示，当发酵液初始pH 4.5时，感官评定分数和红色素提取量均达到最高，分别为8分和0.027 3 mg/g。这可能是发酵pH影响了胭脂萝卜中硫苷酶的活性，黑芥子酶的最适pH为6，研究发现pH下降至3左右时其活性降低70%[11]。发酵液处于低pH时黑芥子酶受到抑制作用和对硫苷的分解，从而影响了萝卜色素中异味物质的产生。同时，当pH超过4.5时，红色素的提取量逐渐降低，这可能是花青素结构由稳定的醌式结构逐渐变成无色的不稳定的拟碱式或者查尔酮式形式，导致萝卜红色素溶解度下降所致[30]。综上所述，选择发酵液初始pH 4.5进行响应面优化试验。

图3 发酵液初始pH对胭脂萝卜红色素异味和红色素提取量的影响

2.1.4 接种量对胭脂萝卜红色素异味和提取量的影响

如图4所示，当酵母菌接种量不断提高时，萝卜红色素异味先减少后增加。接种量1%时，感官评价分数最高，为8分。接种量超过1%时，感官评分逐渐降低。这可能是随酵母菌接种量增大，发酵速率变快，代谢加强，菌种之间竞争激烈，代谢路径发生改变，影响硫苷分解后的代谢产物种类、含量，增加异味物质的种类和含量；同时，可能酵母菌利用萝卜中的糖类物质，生产一些新的异味物质。菌种量1.2%时，红色素提取量最高，为0.023 9 mg/g。综上所述，选择接种量0.8%，1.0%和1.2%进行响应面优化试验。

图4 接种量对胭脂萝卜红色素异味和红色素提取量的影响

2.2 微生物发酵法脱除胭脂萝卜红色素异味的工艺优化

2.2.1 响应面试验设计及结果

响应面试验安排及结果见表3。

表3 响应面试验安排与结果

2.2.2 回归模型建立及方差分析

通过Design-Expert 12软件对回归模型进行分析，得出拟合回归方程：感官评分=7.85+0.050A-0.003 333B-0.20C+0.036D-0.30AB-0.12AC-0.36AD-0.25BC-0.056BD-0.13CD-1.08A2-92B2-1.16C2-1.31D2。

由表4可知，对回归模型进行显著性检验和方差分析。该模型P＜0.01，说明该模型极显著。失拟项P值为0.106 9＞0.05不显著，确定系数R2=0.990 5，模型变异系数为2.1%，远小于10%。说明该模型拟合度较好、可信度高、相关性好，可用于有效预测萝卜红色素异味的感官评分变化情况，进而有效验证工艺的准确性。模型中C、AB、AD、BC、A2、B2、C2、D2均极显著（P＜0.01），BC显著（P＜0.05）。从表4中F值可知，各因素对萝卜红色素异味的影响顺序为：发酵时间（C）＞接种量（A）＞发酵液pH（D）＞发酵温度（B）。

表4 响应面回归方程方差分析

接表4

2.2.3 交互作用分析

图6 接种量和发酵液初始pH的交互作用对胭脂萝卜红色素脱臭效果的影响

图5～图7中响应面坡度均较陡峭，等高线呈椭圆形，说明发酵时间与菌种接种量、发酵pH与接种量以及发酵温度和发酵时间的交互作用均显著，对感官评分的影响较大。这与方差分析结果一致。

图5 接种量和发酵时间的交互作用对胭脂萝卜红色素脱臭效果的影响

图7 发酵时间和发酵温度的交互作用对胭脂萝卜红色素脱臭效果的影响

2.2.4 验证试验结果

根据响应面模型预测微生物发酵法脱除萝卜红色素异味的最佳工艺参数：菌种接种量1.005%、发酵时间36.071 h、发酵温度为25.821 ℃、发酵液初始pH 4.507，按此工艺参数制备的萝卜红色素的感官评分可达7.854分。考虑到实际操作的简便性，将试验方案适当调整为酵母菌接种量1%、发酵时间36 h、发酵温度25.5 ℃、发酵液初始pH 4.5。按此工艺进行3次平行试验，感官评分为7.82±3分，与预测值7.854分接近，说明该模型适合红色素脱臭工艺条件的预测。

2.3 质量评价

2.3.1 感官指标

胭脂萝卜红色素异味的感官指标：无胭脂萝卜异味，酵母发酵味淡；脱臭萝卜红色素的色泽鲜艳，与未脱臭的萝卜红色素相比较，无明显差异。

2.3.2 红色素提取量

在最优脱异味工艺条件下制备的红色素的提取量达到0.036 3 mg/g，而对照试验的红色素提取量为0.037 1 mg/g。由此可见，微生物发酵法不仅可以有效脱异味，而且对萝卜红色素的提取量无显著（P＞0.05）影响。

3 结论

试验采用果酒酵母发酵脱除胭脂萝卜红色素异味。通过单因素试验和响应面优化试验，确定脱除萝卜红色素异味的最优工艺参数：菌种接种量1%、发酵时间36 h、发酵温度25.5 ℃、发酵液初始pH 4.5。在此条件下制得的萝卜红色素基本无胭脂萝卜异味，酵母发酵味淡，感官评分是7.82分，红色素提取量为0.036 3 mg/g，与未脱臭的萝卜红色素提取量无显著差异（P＞0.05）。说明果酒酵母菌发酵不仅能有效脱除萝卜红色素中的异味，而且基本不会影响萝卜红色素提取量和色泽。试验建立一种新的减少或消除胭脂萝卜红色素的异味方法，为扩大萝卜红色素的应用范围提供技术支持，为萝卜红色素的工业化生产提供方法指导和理论基础。