烟富8 苹果脱毒苗木工厂化育苗技术体系的建立

2022-08-04隋秀奇王义伟王文梅顾雨非王厚臣

中国果树 2022年7期

关键词：烟富培苗海棠

隋秀奇，刘聪，王义伟，王文梅，顾雨非，王厚臣

（1 烟台现代果业科学研究院，山东 264003）

（2 诸城市林业发展中心）

（3 诸城市桃林镇三区共建服务中心）

烟富8 是烟台现代果业科学研究院从烟富3 苹果芽变中选育的浓红型品种，2018 年获得植物新品种权，大果，高桩，表光好，星点小；着色早，弱光即可着色，上色快，着色全面[1]；果肉黄色，品质好；硬度高，耐贮性好，在全国已大面积推广。

M9T337 是从M9 组培苗中选育出的苹果矮化砧，嫁接品种后结果早、干性强、易成花，对土壤和气候适应性广，是目前推广的主流矮化砧[2]。

八棱海棠根系深广，与苹果树嫁接亲和力好，适应性和抗逆性均强[3]，耐干旱和湿涝，还有耐盐碱[4]、丰产性好等优点，是目前主要的苹果乔化砧[5]。

苹果树一旦感染病毒病，终生不愈，并且具有传染性。病毒侵染后，苹果树生长量减小，产量锐减，品质变劣，需肥量增加，但是肥效很差。我国当前已经鉴定明确的有17 种苹果病毒，其中6 种属于重点检测对象[6-7]，分别是苹果锈果类病毒（ASSV）、苹果绿皱果类病毒（AgrCV）、苹果花叶病毒（ApMV）3 种非潜隐性病毒[8]和苹果茎沟病毒（ASGV）、苹果茎痘病毒（ASPV）和苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）3 种潜隐性病毒。潜隐性病毒侵染苹果树后，一般不表现典型症状，外观上不易识别，但造成树势衰弱、产量下降等问题[9]。苹果非潜隐性病毒通常在苹果栽培品种上都能表现出典型的症状，容易识别，对树体危害很大[10]。目前还没有完全有效的药剂抑制病毒病的发生。加快优良品种无病毒苗木的繁育与推广，实现苹果无毒化栽培是防治病毒病的根本途径，也是我国苹果产区亟待解决的问题[11]。

1 无毒组培苗的获取

1.1 试验材料

苹果砧木品种M9T337、八棱海棠和苹果品种烟富8 均取自烟台现代果业有限公司试验基地。

蔗糖、无水乙醇、琼脂等药品及6-BA（6-苄氨基嘌呤）、IBA（吲哚丁酸）等植物生长调节剂均购自济南东宙伟业化工有限公司，均为分析纯。

所用的基本培养基为MS 培养基，根据不同环节的要求，附加不同的植物生长调节剂，再加3%的蔗糖、0.7%的琼脂，pH 值调整为5.8。用圆形玻璃组培瓶分装，每瓶分装40 mL，在1 kg/cm2压力下高温灭菌20 min。然后在植物组织培养接种室内接种，再将接种好的外植体放在温度为（26±1）℃、光强1 000 lx、光照12 h/d 的培养室中培养。

1.2 试验方法

（1）取样与消毒。生长季节分别提取M9T337、八棱海棠和烟富8 的正在生长的嫩梢，取前端5 cm，进行消毒处理后，放到盛有MS 营养液的培养瓶内让其生长，然后采顶芽进行取样消毒接种。

（2）茎尖培养建立无菌体系。当培养瓶内的芽抽生出1.0 cm 左右时，移至超净工作台上，从新梢上剪取顶端嫩芽，浸入到75%酒精中消毒8 s，然后取出在灭菌水下冲洗3～4 次，放置在无菌滤纸上吸干水分，再在0.1%的升汞液中消毒8～12 min，再用无菌水冲洗3～5 次，在无菌纸上吸干水分后，接种在配制好的培养基中，在植物组织培养室内进行无菌培养。M9T337、八棱海棠和烟富8 培养基用MS＋0.5 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L IBA＋7 g/L 琼脂＋30 g/L 蔗糖。

（3）剥取茎尖初脱毒。20 d 后，在超净工作台上，用解剖刀剥离无菌组培苗幼叶至裸露的生长点，切下带1～2 个叶原基的生长点（基本不带毒），转移至培养基上，培养基用MS＋2.0 mg/L 6-BA＋0.5 mg/L IBA＋7 g/L 琼脂＋30 g/L 蔗糖，放置在植物组织培养室内进行无菌培养。

（4）高温钝化脱毒。组培苗生长到2 cm 左右时，将无菌瓶苗放在38～40 ℃的智能人工气候箱里生长30 d 左右，使组培苗携带的各种病毒在高温下逐渐钝化，失去活性。

（5）二次茎尖剥离脱毒。对存活的经过高温钝化的无菌瓶苗，进行二次茎尖剥离，得到0.2～1.0 mm 长的无毒茎尖，重新转移到MS＋2.0 mg/L 6-BA＋0.5 mg/L IBA＋7 g/L 琼脂＋30 g/L 蔗糖的培养基中，在植物组织培养室内进行无菌培养。

1.3 病毒检测

经过初次茎尖剥离脱毒、高温钝化脱毒和二次茎尖剥离脱毒的组培苗，生长到2 cm 之后，委托中国农业科学院果树研究所进行病毒检测。

2 无毒茎尖的增殖培养

在无菌接种室内的超净工作台上，已脱毒的组培苗茎尖接种到快繁培养基内进行增殖培养。扩繁瓶苗培养周期为25 d，25 d 后再分瓶接种。这种繁殖方式是在无菌、密闭的情况下进行，不会再感染外界病毒。M9T337、八棱海棠、烟富8 扩繁培养基为MS＋6-BA＋IBA＋7 g/L琼脂＋30 g/L蔗糖，6-BA浓度有0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L 4 个，IBA 浓度有0.1、0.3、0.5、0.7 mg/L 4 个，进行6-BA 浓度和IBA浓度配比筛选。每个植物材料和每个浓度组合接种5 瓶，每瓶接种5 株，培养25 d，选取最佳浓度组合，统计增殖系数。

试验发现，随着6-BA 浓度的增加，增殖系数增加，但组培苗基部簇生状明显，部分组培苗出现玻璃化无用苗，确定6-BA 最佳浓度为1.5 mg/L，IBA因植物材料不同而有差异。M9T337 和八棱海棠扩繁培养基适宜配方为MS＋1.5 mg/L 6-BA＋0.3 mg/L IBA（表1、表2），烟富8 扩繁培养基适宜配方为MS＋1.5 mg/L 6-BA＋0.1 mg/L IBA（表3）。

表1 脱毒M9T337 增殖培养基中IBA 与6-BA 不同组合浓度的增殖系数

表2 脱毒八棱海棠增殖培养基中IBA 与6-BA 不同组合浓度的增殖系数

表3 脱毒烟富8 增殖培养基中IBA 与6-BA 不同组合浓度的增殖系数

试验中发现，随着6-BA 浓度的增加，增殖系数增加，但组培苗基部簇生状明显，部分组培苗出现玻璃化无用苗，针对簇生状苗和玻璃化苗，在M9T337、八棱海棠、烟富8 扩繁培养基中均分别添加GA30.1、0.3、0.5、0.7 mg/L，每个浓度接种10瓶，每瓶5 株，培养25 d，观察统计增殖培养组培苗高度和玻璃化苗发生率，GA3浓度以0.5 mg/L 为最佳（表4）。

表4 脱毒M9T337、八棱海棠、烟富8 增殖培养基中添加不同浓度GA3苗高及玻璃化苗发生情况

苹果砧木M9T337 和八棱海棠增殖培养基最佳配方均为MS＋1.5 mg/L 6-BA＋0.3 mg/L IBA＋0.3 mg/L GA3＋7 g/L 琼脂+30 g/L 蔗糖，烟富8 增殖培养基最佳配方为MS＋1.5 mg/L 6-BA＋0.1 mg/L IBA＋0.3 mg/L GA3＋7 g/L 琼脂＋30 g/L 蔗糖。

3 无毒苗的生根培养

无病毒苗繁殖到一定数量后，单株接种到生根培养基上进行生根培养。生根培养基为1/2MS＋1.5 mg/L IAA＋0.15 mg/L IBA＋5.3 g/L 琼脂＋20 g/L 蔗糖，pH 值5.8[7]，M9T337、八棱海棠和烟富8 的生根数和生根长度均很好。

生根瓶苗在无菌培养室内培养15～18 d，根长到1 cm 左右，完成生根培养。

4 无毒苗的温室驯化

经过生根的脱毒苗，转移到温室，先带盖驯化锻炼7 d，再打开培养瓶瓶口驯化锻炼3～5 d。驯化结束后，从瓶中取出脱毒苗，用清水洗掉培养基，然后在0.1%的多菌灵溶液中蘸一下，移栽到海草穴盘内。小苗生长到4～6 片叶时，转移到温室外遮阳网下适应3～5 d，逐渐适应自然环境。

5 建立原始一代脱毒砧木、品种采穗圃

已适应自然环境的烟富8 和M9T337 穴盘苗，3月下旬至4 月下旬定植到防虫网室中（防止昆虫传播），建立原始一代的脱毒烟富8 和M9T337 采穗圃。在圃中生长50 d 左右，苗木粗度在0.6 cm 以上，芽体成熟，就可以提供原始一代烟富8 和M9T337无毒苗木接穗。

经过温室驯化锻炼的八棱海棠和M9T337 穴盘苗，3 月下旬至4 月下旬移栽到育苗圃中，分别用作培养乔化苗和自根砧苗的砧木。

采穗圃和育苗圃内都采用大小行栽植，大行行距80 cm，小行行距20 cm，株距5～10 cm。

6 培育无病毒苗木

在脱毒的砧木上嫁接原始一代的脱毒接穗，生产的苗木即为脱毒苗木。

为了提高苗木出圃率，在肥水管理方面要做到精细管理。当幼苗长到10 cm 以上时，根系已经有了一定的吸收能力，可以通过水肥一体化设施施肥浇水，也可随浇水或降雨，每667 m2撒施高氮水溶肥4～5 kg。以后间隔20 d 左右追施1 次，每次每667 m2增加2 kg 左右。前期用高氮中磷低钾肥，7—8 月追施低氮中磷高钾水溶肥，促使苗木充实健壮。适宜的土壤田间持水量为60%～80%，根系周围土壤手握成团不滴水为宜，降到60%以下时必须浇水，天气干旱时，间隔7～10 d 浇1 次，遇中雨可以不浇水。多雨季节，要注意排水，防止渍涝伤害幼苗。

脱毒八棱海棠和M9T337 砧木苗在苗圃生长50 d 左右，苗木基部10 cm 左右高处粗度在0.6 cm 左右时，取防虫网室中原始一代烟富8 无毒苗木接穗，采用带木质芽接法嫁接，经过1～2 年的生长，就培育出可出圃的脱毒乔化或矮化自根砧苗木。

脱毒的八棱海棠砧木苗在苗圃生长50 d 左右，苗木基部10 cm 左右高处粗度在0.6 cm 左右时，取防虫网室中的原始一代M9T337 无毒苗木接穗，采用带木质芽接法嫁接。8 月底9 月初，再取防虫网室中的原始一代脱毒烟富8 品种芽，在M9T337 中间砧20～25 cm 高度上嫁接，第2 年春季在M9T337中间砧嫁接芽上剪砧，第2 年秋季可育成优质双脱毒矮化中间砧烟富8 苹果苗。