基于计量学方法分析数字PCR技术的临床应用现状与技术热点

门佩璇， 肖宇锋， 张玢

中国医学科学院医学信息研究所/图书馆，北京 100005

1985年，Kary Mullis发明了用于核酸检测的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术［1］；1992年，Sykes等［2］检测lgH重链突变基因时，采用了有限稀释，虽然没有明确提出“数字PCR”的概念，但建立了数字PCR基本的实验流程，并且确定了数字PCR检测中极其重要的原则，即以“终点信号的有或无”作为定量方法，并制定了与泊松统计相结合进行绝对测量的策略；1999年，Vogelstein等［3］首次提出了数字PCR的概念，其在检测大肠癌患者的K-RAS突变时，进行了微升（µL）级别的PCR扩增，分别用不同荧光检测突变基因和正常基因，通过计算突变基因和正常基因的比例得出突变率。2003年，Liu等［4］在此基础上提出微流体概念，通过微泵微阀对DNA模板进行自动分液，提高了样本稀释精确度，降低了操作误差，促进了数字化PCR的临床应用。随着技术的不断发展与优化，PCR技术从第一代终点PCR（end point PCR）逐渐发展为第二代定量PCR（quantitative PCR，qPCR）、第三代数字PCR（digital PCR，dPCR），其中dPCR首先通过对核酸模板进行一定程度的稀释，然后将其随机分配于大量的反应单元中进行扩增，当反应结束时依次对每个反应单元的阳性信号进行统计，从而实现对核酸分子的定量分析，与传统PCR相比，dPCR技术具有高灵敏度、高重复性、绝对定量、高耐受性、样本需求量低等优势［5］。目前，dPCR已应用于肿瘤液体活检、无创产前筛查、病毒核酸检测、罕见突变检测、移植排斥监测等领域。dPCR的主要临床应用领域详见表1。

表1 dPCR的主要临床应用领域[6]Table 1 Main clinical application fields of dPCR[6]

既往研究主要在文献复习的基础上对dPCR技术的临床应用进行了归纳总结，未开展多维度的态势分析，且忽略了结合专利角度分析dPCR技术的临床应用转化。本文检索并收集了国内外发表的数字PCR技术临床应用文献与公开发明专利，基于计量学方法，从时间和空间维度明晰该技术在临床上应用的发展态势，明确从事该技术研究的主要机构和其主要研究内容与方向，并采用可视化软件对分析结果进行直观展示，旨在辅助相关科研人员、企业和决策制定者快速把握领域现状与趋势，以期为进一步开展dPCR技术研究提供参考。

1 数据来源与方法

1.1 数据来源

以1999年至2021年中国生物医学文献数据库、PubMed医学文献检索服务系统及Incopat专利数据库收录的与“数字PCR技术临床应用”相关的中英文期刊论文和专利文献为数据源，中文以“数字PCR技术”为关键词，英文以“digital PCR”或者“dPCR”为关键词，进行检索和筛选，共获得数字PCR临床应用与技术相关的期刊论文2 773篇（英文1 873篇、中文275篇）、专利900件，下载、保存、记录文献和专利信息。

1.2 研究方法

采用文献计量学的方法，对数字PCR临床应用与技术领域的文献及专利进行态势分析，主要包括发文年代、国家与机构的分布情况等。通过DDA软件分别对中英文文献的关键词进行提取，使用主流的文献可视化软件VOSviewer，分别对数字PCR临床应用与技术的中英文文献的研究热点进行聚类展示。采用专利地形图对技术领域进行聚类，分析发明专利总数较高的国家主要国际专利分类技术种类，并通过专利地形图对国内外公开专利的主要技术领域进行聚类展示。

2 结果与分析

2.1 文献研究态势

2.1.1 发文量年度变化趋势 对1 873篇数字PCR技术临床应用研究英文文献和275篇中文文献的发表年份进行统计，如图1所示，20世纪末开始陆续出现数字PCR技术的相关论文，研究热度逐年升高。英文文献数量自2013年开始快速增长，至2018年一直呈逐年上升的趋势，且在2018年达到最大值，表明2013年开始数字PCR技术逐渐成为国际基因诊断检测领域的新兴热点；中国数字PCR临床应用研究起步于2010年左右，至2016年呈快速增长的趋势，2016—2019年增长较平稳，至2020年达到最大值，分析可能与新冠病毒疫情检测中推广使用数字PCR技术有关。

图1 数字PCR技术中英文文献发表年代分布Fig.1 The publishing years distribution of Chinese and English literatures on dPCR technology

2.1.2 主要国家 对英文文献的发文国家进行统计，结果如图2所示，文献主要集中于美国、中国、日本等国家。排名前10的国家发文量共计1 698篇，约占总发文量的91%。美国和中国发文量分别为356篇和279篇，占比19%和15%，明显领先于其他国家，说明虽然中国在数字PCR技术应用领域的研究起步较晚，但进步较快。

图2 数字PCR技术英文文献国家分布Fig.2 National distribution of English literature on digital PCR technology

2.1.3 主要研究机构 排名前10的研究机构中，科研论文发表的主体仍是各国的高等院校。美国数字PCR技术应用于肿瘤研究领域的文献数量最多，Bio-Rad公司是国际数字PCR技术应用领域的领军企业，拥有最早的相对成熟数字PCR平台，因此文献数排名第3（表2）。国内发表的中文文献数量较多的机构为复旦大学附属中山医院（6篇）、中国计量科学研究院（6篇）、中国检验检疫科学研究院（6篇）、中国动物疫病预防控制中心（6篇）、山东省出入境检验检疫局（5篇）和复旦大学附属华山医院（5篇），说明新型冠状病毒疫情极大地推动了数字PCR技术在我国进行病毒核酸检测的实际应用。

表2 数字PCR技术英文文献主要发文机构（Top 10）Table 2 Main institutions of publishing English articles on dPCR technology（Top 10）

2.1.4 论文研究热点主题 对1 873篇英文文献提取的294个关键词进行共现分析，如图3所示，数字PCR临床应用的热点内容包括4个方面。①蓝色部分：数字PCR技术在线粒体DNA拷贝数变异机制、基因表达、调控和转录分析，以及缺失区域和功能的探测和机制研究，依据个体基因变异不同定制个性化治疗方案等研究；②红色部分：运用数字PCR技术开展新冠病毒等检测工作，实现精准的绝对定量，为病毒检测提供替代技术和新方法的临床应用研究；③绿色部分：使用数字PCR技术和液体活检方法，对循环DNA和游离DNA的体细胞突变、ESR1突变、BRAF突变、PIK3CA突变和KRAS突变等进行早期探测和检查，主要应用于结直肠癌、黑色素瘤等肿瘤的早期诊断，存活、复发和进展等结局研究，预后价值及多变量分析研究等；④黄色部分：表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKI）等治疗小细胞肺癌、非小细胞肺癌的研究，EGFR-TKI、EFGR、L858R和T790M突变等作用机制的研究。表明数字PCR技术的临床应用热点领域是肿瘤诊断、病毒检测和基因表达分析等，其他领域研究尚处于小规模探索阶段，未形成聚类簇团。

图3 数字PCR技术英文文献研究热点Fig.3 The hotspots of English articles on dPCR technology

2.2 专利研发态势

2.2.1 专利数量年度变化 如图4所示，数字PCR技术最早在2018年才有专利公开，中国在该领域的发明专利数量远超美国，并呈逐年增多的趋势。美国申请专利的时间早于中国，美国最早于2007年在欧盟、西班牙、丹麦、立陶宛、波兰等国家或地区申请了一件《通过数字分析的无创胎儿遗传筛选》的专利［7］，但直至2019年才公开，该专利是将数字PCR技术应用于产前诊断领域，检测唐氏综合征等多倍体突变。中国最早于2015年申请了3件数字PCR相关专利，主要应用于产前诊断和病毒检测领域。

图4 中国、美国和全球数字PCR技术来源国公开发明专利趋势Fig.4 Trends of public invention patents in China,the United States and countries of origin of global digital PCR technology

2.2.2 专利技术来源国分布 如图5所示，对数字PCR专利的主要技术来源国进行统计，中国的专利申请人公开相关专利数量达到558件，居首位，其次为美国，公开133件，日本、韩国和德国均未超过50件。虽然中国的专利申请和公开时间均晚于美国，但数量却远超美国，表明我国在数字PCR技术研发阶段已处于领先趋势。

图5 数字PCR技术来源国公开发明专利总数Fig.5 Sum of publication of invention patent from technology source country

2.2.3 主要专利申请机构 国内外公开专利数量超过4件的申请人共32家，其中来自国外的申请人仅6家，其他26家均为国内企业或科研单位。公开发明专利数量排名前20的机构如表3所示。中国多家企业及出入境检验检疫局的专利申请量较高，表明我国对数字PCR技术的研发热情较高。2016年我国国家重点研发计划——“新一代高通量数字PCR关键技术及应用研究”资助研发拥有自主知识产权的新一代数字PCR系统，有望普及低成本、高通量、易用型数字PCR技术。

表3 国内外数字PCR技术主要专利申请人（Top 20）Table 3 Main patent applicants of dPCR technology（Top 20）at home and aloroad

2.2.4 技术研发热点主题 中国的主要IPC技术是C12Q1/6851（定量扩增）、C12N15/11（DNA或RNA片段修饰形成）、C12Q1/686（聚合酶链式反应）；主要用于C12Q1/70（包括病毒或噬菌体）、C12Q1/6886（癌症）、C12Q1/689（细菌）、C12Q1/6895（植物、真菌或藻类）、C12Q1/10（用于肠杆菌）等。美国的主要IPC与中国类似，包括C12Q1/686（聚合酶链式反应）、C12Q1/6851（定量扩增）、C12Q1/6858（等位基因特异性扩增）等。使用专利地形图对国内外公开专利的数字主要技术领域进行聚类分析，结果表明，国内的主要技术热点有引物探针、核苷酸序列、DNA定量检测、试剂腔室、微流控芯片等（图6）。美国未显示出较大规模的技术热点，专利申请主要聚焦于微流体通道、氟表面活性剂、靶序列、辐射吸收层、光吸收层等方面（图7）。

图6 中国dPCR技术发明专利热点Fig.6 Hotspots of invention patents on dPCR technology in China

图7 美国dPCR技术发明专利热点Fig.7 Hotspots of invention patents on dPCR technology in USA

3 讨论

随着分子生物学技术的飞速发展，分子诊断技术取得了显著的进步，尤其是在新型冠状病毒肺炎疫情全球蔓延的大背景下，以数字PCR为代表的分子诊断技术迎来了黄金发展契机。我国数字PCR技术研究虽起步晚于美国、日本等发达国家，但发展趋势较好，尤其是在专利申请方面，已展现出国际领先地位，与前人研究结果一致［8-9］。

数字PCR技术的科学研究主体仍是各国的高等院校，但在高频率多元化核酸检测需求的推动下，越来越多的研究中心和企业对数字PCR技术的应用进行了研究。国际上，Bio-Rad、凯杰、赛默飞等公司均通过收购、投资等方式布局数字PCR领域；国内企业也在国家积极鼓励医疗器械的创新环境下，推出了多个自主知识产权的国产数字PCR产品，并实现放量应用。据《2021—2027年中国数字PCR行业发展现状与及发展趋势预测报告》报道［10］，2015—2019年我国数字PCR市场规模从5.47亿元增长至15.84亿元，2019年同比增长27.85%，表现出高度的行业活力，其中具有代表性的企业包括领航基因、新羿制造、锐讯生物等，为全球数字PCR技术专利增长提供了主要动力。

数字PCR技术临床应用的热点主题集中于拷贝数变异研究［11］、肿瘤治疗的伴随诊断与实时监控［12-16］、微生物检测［17-22］等方面。此外，数字PCR技术还可用于基因表达差异研究、移植排斥监控、肠道菌群分析等领域［23-25］，这些研究尚处于小规模探索阶段，未来有望拓展到更广泛的临床实际应用中。

技术的发展遵从定性到相对定量，再到绝对定量的趋势。数字PCR技术在qPCR的基础上，实现了绝对定量。然而，其虽然从实验走向了临床，从国外垄断走向了国内创新企业高速发展，但仍不能满足临床对不同场景的需求［26］，其中操作不便捷和成本昂贵是主要限制因素［27］。未来，研究人员应集中力量攻克研发难点，最大程度减低人为操作造成的损失，实现数字PCR技术分体机的集成；同时开展微流控芯片等反应体系、液滴生成方式和液滴制备数量的探索创新，以最大程度降低数字PCR技术的耗材成本，提升数字PCR技术的临床应用价值。