KIAA1456靶向调控Runx1抑制肺癌A549细胞增殖和侵袭

张杨勇， 冯媛， 王二愿， 周锋， 董济民

(1.延安大学咸阳医院肿瘤放疗科，陕西省咸阳市 712000；2.延安大学咸阳医院肿瘤内科，陕西省咸阳市 712000；3.西安市中心医院肿瘤科，陕西省西安市 710004)

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)为常见的恶性肿瘤，其预后与关键基因调控的肿瘤细胞生长和转移有关[1]。因此，探索新的NSCLC生物学调控基因对NSCLC靶向治疗具有重要意义。转移核糖核酸(transfer RNA，tRNA)在蛋白质翻译中具有重要作用，tRNA修饰蛋白异常表达与肿瘤发展密切相关[2]。人类tRNA甲基转移酶9样蛋白(又称KIAA1456)是一种催化tRNA甲基转移酶[3]，其异常表达干扰正常蛋白翻译和DNA修复，最终导致细胞癌变[4]。KIAA1456在乳腺、结肠、膀胱等多肿瘤组织中表达降低[5]，过表达KIAA1456后肿瘤细胞迁移和生长速率均明显下降[6]，但目前尚不清楚KIAA1456在肺癌中的生物学功能。因此，本研究推测KIAA1456可能是一个潜在的抑癌基因，检测了KIAA1456在肺癌组织的表达，以及KIAA1456表达对A549细胞增殖和侵袭的影响，并探讨其潜在分子机制。

1 资料和方法

1.1 主要试剂和仪器

人非小细胞肺癌A549细胞(中国科学院上海细胞库)；miRNA阴性对照(miRNA negative control，miR-NC)、KIAA1456 RNAi和pCDNA3.0-HA-KIAA1456质粒(上海吉凯生物公司)；四甲基偶氮唑盐(Methyl tihiazolyl tetrazolium，MTT)(美国Amresco公司)；细胞蛋白抽提试剂盒(碧云天生物技术研究所)；KIAA1456、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、Runt相关转录因子1(runt-associated transcription factor 1，Runx1)、金属基质蛋白酶-9(metallic matrix proteinase-9，MMP-9)、β-actin和HRP标记山羊抗鼠二抗(武汉博士德生物工程公司)；多功能酶标仪(美国Ther-mo Revco公司)；24孔Transwell小室(美国CORNING科技有限公司)。

1.2 一般资料

收集本院2013年1月—2015年10月行手术切除经病理确诊的肺癌患者91例，年龄(69.27±14.13)岁，收集患者临床病理特征、肺癌组织和癌旁组织标本，并随访5年进行生存分析。本研究获得本院伦理审查委员会批准，并经患者及家属知情同意。

1.3 免疫组织化学法测定组织中KIAA1456表达

肺癌组织和癌旁组织经脱水、包埋、切片，烤片后常规脱蜡，用胃蛋白酶进行抗原修复，3%H2O2处理20 min，室温下10%绵羊血清封闭20 min，然后添加KIAA1456抗体(1∶1 000 )，4 ℃孵育过夜，加入通用二步法检测试剂(30 min)，加入二氨基联苯胺底物进行显色，苏木精复染，脱水，透明，封片，显微镜下观察，棕褐色染色的细胞为阳性细胞。使用ImageJ软件分析染色强度得分0分(阴性)、1分(弱阳性)、2分(中等阳性)和3分(强阳性)；染色阳性细胞占比得分1分(1%～24%)、2分(25%～49%)、3分(50%～74%)和4分(75%～100%)。将以上两个分数相乘后，得分<6分为KIAA1456低表达，≥6分为KIAA1456高表达[7]。

1.4 细胞培养和转染

37 ℃、5%CO2下用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养A549细胞，当细胞融合至70%左右时进行实验。将A549细胞分为阴性对照组、NC对照组、KIAA1456 RNAi组和KIAA1456质粒组。阴性对照组细胞不进行处理，NC对照组、KIAA1456 RNAi组和KIAA1456质粒组细胞用Lipofectamine法分别将miR-NC、miR-NCKIAA1456 RNAi和pCDNA3.0-HA-KIAA1456质粒转染到A549细胞，继续培养48 h后进行相关检测。

1.5 MTT法检测细胞增殖率

处理细胞后，将细胞接种于96孔板中(5×103个/孔，200 μL/孔)，48 h后每孔加入20 mL MTT，继续培养4 h，弃培养基，每孔加入200 mL二甲基亚砜，振荡10 min，用酶标仪测定光密度(OD)，计算细胞增殖率。

1.6 Transwell法检测细胞侵袭能力

处理细胞后，将细胞接种于Transwell小室中，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，48 h后取出小室，甲醛固定10 min，结晶紫染色30 min，冲洗干净后计数紫色染色的细胞数。

1.7 Western blotting法检测细胞KIAA1456、Cyclin D1、Runx1和MMP-9的表达

处理细胞后，将细胞接种于6孔板中(1×106个/孔，3 mL/孔)，48 h后收获细胞，加入细胞蛋白抽提液(100 μL)，电泳(20 μg/孔)，切胶后转膜，将膜与KIAA1456(1∶400)、Cyclin D1(1∶200)、Runx1(1∶200)和MMP-9(1∶400)进行孵育，4 ℃孵育过夜，洗膜后用HRP标记山羊抗鼠二抗(1∶10 000)室温下孵育(30 min)，显色、采集图像进行分析，以β-actin为内对照。

1.8 统计学分析

2 结 果

2.1 肺癌组织和癌旁组织KIAA1456表达的比较

KIAA1456蛋白主要表达于细胞质中。91例肺癌组织中有44例(48.35%)低表达，47例(51.65%)高表达；91例癌旁组织中有22例(24.18%)低表达，69例(75.82%)高表达；KIAA1456在肺癌组织中的高表达率明显低于癌旁组织(P<0.05；图1)。

图1 KIAA1456在肺癌患者癌旁组织(A)和肺癌组织(B)中的表达(苏木精染色，400×)

2.2 KIAA1456表达与临床病理特征的关系

KIAA1456在不同淋巴结转移、TNM分期分层间表达有差异(P<0.05；表1)。

表1 KIAA1456表达与肺癌患者临床病理特征的关系 单位：例(%)

2.3 KIAA1456表达与肺癌患者预后的关系

Kaplan-Meier生存分析显示，KIAA1456高表达的肺癌患者5年总生存率明显高于KIAA1456低表达的肺癌患者(P<0.05；图2)。

图2 KIAA1456表达与肺癌患者预后的关系

2.4 KIAA1456表达对A549细胞增殖和侵袭的影响

与阴性对照组和NC对照组比较，A549细胞增殖率和侵袭细胞数KIAA1456 RNAi组增加，KIAA1456质粒组降低，KIAA1456质粒组低于KIAA1456 RNAi组(P<0.05；表2和图3)。

表2 KIAA1456表达对A549细胞增殖和侵袭的影响(n=3)

图3 KIAA1456表达对A549细胞侵袭的影响(苏木精染色，200×)

2.4 KIAA1456表达对A549细胞Cyclin D1、Runx1和MMP-9的影响

与阴性对照组比较，KIAA1456 RNAi组A549细胞Runx1表达降低、Cyclin D1和MMP-9表达增加；KIAA1456质粒组A549细胞Runx1表达增加，Cyclin D1和MMP-9表达降低(P<0.05；图4)。

图4 KIAA1456表达对A549细胞Cyclin D1、Runx1和MMP-9的影响a为P<0.05，与阴性对照组比较。

3 讨 论

研究发现，KIAA1456基因是一种潜在的抑癌基因，与肿瘤生长呈负相关。在卵巢癌中，晚期肿瘤的KIAA1456表达比早期肿瘤低约30%[8]。同时，KIAA1456过度表达与5-氟尿嘧啶的治疗益处相关，并且结肠癌患者粪便样本中KIAA1456 mRNA的存在与更有利的预后相关[9]。KIAA1456也被称为药物激活基因过表达，在顺铂和紫杉烷诱导的HCT116 Runx1+/+细胞中表达，但在HCT116 Runx1-/-细胞中不诱导表达[10]。然而，目前还没有关于KIAA1456基因在肺癌中的研究。

本研究免疫组化结果显示，KIAA1456在肺癌组织中表达水平低于癌旁组织，同时，KIAA1456在不同淋巴结转移、TNM分期分层间表达有差异，KIAA1456高表达患者术后5年生存率高于低表达患者。因此，本研究推测KIAA1456也可能在NSCLC的进展中发挥重要作用。利用培养的A549细胞研究其机制发现，KIAA1456通过调节影响肿瘤细胞恶性行为功能蛋白的表达，减少了癌细胞增殖和侵袭。

肺癌是一种侵袭性高、易远处转移的恶性肿瘤，上皮间质转化是促进肺癌细胞侵袭转移的重要机制之一，是肺癌高死亡率的主要原因之一。KIAA基因是大分子蛋白质基因数据库(HUGE)中的一员，KIAA0247基因位于人类染色体16q22.1上，基因高度保守，在免疫炎症反应时KIAA0247表达明显增多，参与脂多糖及补体控制蛋白；同时在该染色体还包含Runx1基因，该基因导致肺组织损伤、肺气肿和肺癌中α1-抗胰蛋白酶缺乏。尽管KIAA1456在癌症中未发生突变，但由于在其启动子区域中发现了Runx1反应元件，因此已提示其在肿瘤发生中起作用，这表明KIAA1456是Runx1的潜在靶标[11]。通过转基因小鼠模型研究发现，Runx1在肺泡上皮中的低表达与原癌基因途径协同促进了NSCLC的发展。同时，Runx1通过调节MMP-9的稳定性来抑制MMP-9介导的侵袭，这是肺腺癌生长所必需的[12]。另一项研究表明，KIAA1456过表达抑制骨肉瘤细胞系的增殖和血管生成，并通过抑制MMP-9表达来抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移[13]。此外，细胞增殖依赖于细胞周期G1期的进展，Cyclin D1是细胞周期蛋白家族的一员，其与人细胞周期素依赖激酶4蛋白结合，加速细胞周期的进展，从而促进肿瘤细胞增殖[14]。本研究结果显示，KIAA1456上调后促进Runx1表达，通过抑制下调Cyclin D1和MMP9来抑制细胞增殖和侵袭。

综上所述，KIAA1456在肺癌组织中呈低表达，并与肺癌的临床病理特征及预后明显相关，可作为抑癌基因，过表达KIAA1456通过靶向调控Runx1的表达可抑制A549细胞增殖和侵袭。KIAA1456可作为一种新的肺癌检测生物学指标，对肺癌的早期诊断和靶向治疗具有重要意义。