百会透曲鬓调控EGFR/STAT3通路抑制脑出血大鼠神经功能损伤的机制研究

许文婷,薛玉满,王 策,孔 莹△,邹 伟,4△

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001；3.成都中医药大学,四川 成都 610075； 4.黑龙江中医药大学附属第一医院,黑龙江 哈尔滨 150040)

脑出血(Intracerebral hemorrhage，ICH)是神经内科的常见病、多发病，病情危重，致残率和病死率均较高，其发病率随着人口老龄化加剧而逐年上升[1]。脑出血在我国发病率约为20%，远高于欧美国家[2]，发病后30 d内死亡率超过40%[3]，是急性脑血管病中致死率最高的亚型[4]，严重危害人类生命健康。除原发性脑损伤外，脑出血后血肿引发的颅内高压、脑疝等继发性脑损伤，是导致大脑神经功能损伤的重要原因[5]。研究发现，脑组织内星形胶质细胞的活化、增殖在脑出血后继发性脑损伤中发挥着极其关键的作用[6]，对星形胶质细胞活化机制的深入研究已成为近年来脑卒中等中枢神经系统疾病靶向治疗的重点关注方向之一[7-8]。EGFR/STAT3 通路被报道参与了脑损伤后星形胶质细胞的活化、增殖过程，降低该通路信号转导能够抑制星形胶质细胞活化，进而减轻脑出血后继发性脑损伤[9-11]。研究证实，针刺“百会”透“曲鬓”对脑出血急性期受损神经细胞有着明显的保护作用[4,12-13]，但关于该方法对脑出血后EGFR/STAT3 信号通路的调控机制尚未见报道。因此，本研究拟采用大鼠自体血注入法复制脑出血模型，诱导星形胶质细胞活化，并给予针刺“百会”透“曲鬓”干预治疗，探讨该方法对脑出血大鼠神经功能损伤的干预效果及对EGFR/STAT3通路的影响，现汇报如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雄性健康SD大鼠，购于黑龙江中医药大学GLP实验动物中心[许可证号：SCXK(吉)-2019-0004]，8周龄，体质量(260±20)g。实验室环境下适应性饲养1周后进行造模分组，饲养条件：12 h/12 h昼夜交替循环，温度(25±2)℃，湿度50%～60%，每8 h自动通风换气，自由进食饮水。

1.2 实验仪器

Lab Standard脑立体定位仪(美国Stoelting公司);FYL-YS-280L实验室大鼠恒温箱(FU.YI.LIAN公司);奥林巴斯BX53荧光显微镜(OLYMPUS公司);Stuart SHM2匀浆器(Bibby-Stuart公司);SDS-PAGE凝胶电泳仪(美国Bio-rad公司，型号：165-8029);CBIO-GelPro凝胶电泳智能成像系统(北京赛百奥科技有限公司);UV5紫外可见分光光度计(METTLER TOLEDO公司)。

1.3 实验试剂

TBST溶液，Triton X-100(国药集团化学试剂有限公司)；山羊血清封闭液，鼠抗GFAP、EGFR抗体，DAB 显色试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)；鼠抗p-JAK1、p-STAT3多克隆抗体，β-actin 抗体(Santa Cruz公司)；Trizol、Rnase试剂盒，逆转录试剂盒(Sigma-aldrich公司)；SYBR Premis Ex Taq Ⅱ(Perfect Real Time)试剂盒(美国NEB公司)。

1.4 造模与分组

取126只实验大鼠随机分为假手术组(n=18)、模型组(n=54)和针刺组(n=54)，模型组和针刺组又按照造模后6 h、3 d和7 d 3个时间点分为3个亚组(n=18)。脑出血模型采用大鼠尾状核自体动脉血注入法复制[9]，将大鼠腹腔注射10 %水合氯醛麻醉，剂量350 mg/kg，俯卧位固定于脑立体定位仪上，调整至前后囟在同一平面上，取双眼、双耳中线交叉处备皮消毒，纵向做一1 cm切口，充分暴露前囟点和冠状缝，以脑立体定位仪定位注血点(以Bregma点为中心，后侧0.2 mm，右侧3.5 mm处)，以牙科钻钻一直径约1.0 mm的圆孔，深度达硬脑膜。将大鼠尾部自尾端3 cm处剪短，以微量注射器取血50 μL后固定于脑立体定位仪上，沿钻孔垂直进针约6 mm，以20 μL/min速度缓慢注入大鼠尾状核内，注血后需留针约5 min，再缓慢拔针。以牙科磷酸锌水门汀封闭钻孔，缝合头皮，局部碘伏消毒。待大鼠麻醉苏醒后，以Bederson评分法为标准，评定为1～3分即为造模成功。假手术组仅模拟造模手术过程，不给予自体血注入。

1.5 干预方法

1.5.1 针刺组 参考《实验动物穴位图谱》选取大鼠百会穴、曲鬓穴，将大鼠固定后消毒穴周皮肤，取毫针(0.25 mm×25 mm)针刺百会穴，针尖朝向右侧曲鬓穴透刺，进针约25 mm，留针30 min，期间以200 r /min速度捻针3次，每次2 min。针刺6 h组大鼠在造模苏醒后即给予1次针刺干预，针刺3 d、7 d组每日给予1次针刺干预。

1.5.2 假手术组、模型组 不作针刺干预，仅每日在针刺相同时间给予1次抓取固定。

1.6 标本采集与检测

1.6.1 神经行为学评分 采用改良大鼠神经功能缺损评分(mNSS)[14]，对造模后各时间点大鼠的神经功能进行评分，总分最高为18分，分值越高表示神经功能损伤越严重。

1.6.2 免疫荧光观察GFAP、EGFR阳性细胞分布 于造模后相应时间点(6 h、3 d和7 d)以10 %水合氯醛麻醉大鼠，开胸后充分暴露心脏，左心室插管行0.9 %生理盐水和4 %多聚甲醛依次心脏灌注，快速断头取脑，置于4 %多聚甲醛液中浸泡24 h，做成5 μm厚冰冻脑片备用。切片滴加0.3% Triton X-100室温通透20 min，PBS漂洗3次×5 min，滴加山羊血清室温封闭1 h，吸净封闭液，滴加稀释好的GFAP、EGFR一抗(1∶100)，4 ℃孵育过夜，PBS漂洗3次×5 min，吸净后滴加稀释好的荧光二抗(1∶100)，37 ℃避光孵育1 h，PBS漂洗3次×5 min，甘油封片后至荧光显微镜下观察。每个样本在200倍镜下随机选取5个视野，使用Image Pro Plus 6.0软件进行图像处理，观察视野内GFAP、EGFR阳性细胞计数。

1.6.3 Western blot检测p-JAK1和p-STAT3蛋白表达 于造模后相应时间点(6 h、3 d和7 d)以10 %水合氯醛麻醉大鼠后快速断头取脑，分离血肿周围脑组织，PBS溶液清洗、剪碎后移至匀浆器中，加4 ℃足量裂解液，匀浆30 min，5 000 r/min离心10 min，取上清液测定蛋白浓度。采用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭孵育2 h，加入稀释好的p-JAK1、p-STAT3一抗(1∶1 00)，4 ℃恒温孵育过夜。TBST漂洗3次×10 min，加入相应的二抗，室温孵育2 h，再次洗膜3次×10 min，加入DAB显色、曝光，采用凝胶电泳智能成像系统扫描、分析实验结果，以各目的蛋白与β-actin的光密度比值表示蛋白的相对表达量。

1.6.4 Real-time PCR检测GFAP、EGFR mRNA水平 采用Trizol法提取脑组织总RNA，加Rnase水适量充分溶解后，紫外分光光度计检测RNA浓度及OD260/OD280，符合实验要求。参照逆转录试剂盒进行cDNA反转录，由invitrogen公司设计合成相应的引物序列，GFAP正向：5′-TAATGACTATCGCCGCCAACTG-3′，反向 ：5′-TTCGCCCTCCGCAATTTC-3′；EGFR正向：5′-CCTGGTCTGGAAGTACGCAG-3′，反向：5′-CGATGGACGGGATCTTAGGC-3′。使用SYBR Premis Ex Taq Ⅱ(Perfect Real Time)试剂盒进行PCR扩增，反应程序：95 ℃,30 s(95 ℃,5 s；60 ℃,30 s；72 ℃,1 s)×40个循环。以GAPDH水平作为内参，以2-△△Ct值表示GFAP、EGFR mRNA的相对表达水平。

1.7 统计学处理

2 实验结果

2.1 各组大鼠不同时间点神经行为学评分比较

与假手术组比较，不同时间点模型组和针刺组大鼠mNSS评分均显著升高(P<0.05) ；与模型组比较，相同时间点针刺组大鼠mNSS评分均明显降低，在第3天、7天时差异有统计学意义(P<0.05)，并随时间呈明显下降趋势。见表1。

表1 各组大鼠不同时间点神经行为学评分比较

2.2 各组大鼠GFAP、EGFR阳性细胞分布

免疫荧光观察各组大鼠7 d时脑组织GFAP、EGFR阳性细胞分布，结果显示，与假手术组比较，模型组和针刺组大鼠的GFAP、EGFR阳性细胞计数明显增多(P<0.05)；与模型组比较，针刺组大鼠的GFAP、EGFR阳性细胞计数明显减少(P<0.05)。见图1、表2。

表2 各组大鼠7 d时GFAP、EGFR阳性细胞计数个·m-2)

图1 各组大鼠7 d时GFAP、EGFR阳性细胞分布(200×)

2.3 各组大鼠不同时间点p-JAK1、p-STAT3蛋白表达比较

脑组织p-JAK1、p-STAT3蛋白表达在脑出血后6 h出现明显增多，并持续升高，至3 d时达到峰值，7 d时可见下降。与假手术组比较，不同时间点模型组和针刺组大鼠的p-JAK1、p-STAT3蛋白表达均显著升高(P<0.05)；与模型组比较，相同时间点针刺组大鼠的p-JAK1、p-STAT3蛋白表达均明显降低，在第3天、7天时差异有统计学意义(P<0.05)。见图2和表3～4。

图2 各组大鼠不同时间点p-JAK1、p-STAT3蛋白表达电泳图

表3 各组大鼠不同时间点p-JAK1蛋白表达比较

表4 各组大鼠不同时间点p-STAT3蛋白表达比较

2.4 各组大鼠不同时间点GFAP、EGFR mRNA水平比较

脑组织GFAP、EGFR mRNA水平在脑出血后6 h出现明显增多，并持续升高，至3 d时达到峰值，7 d时可见下降。与假手术组比较，不同时间点模型组和针刺组大鼠的GFAP、EGFR mRNA水平均显著升高(P<0.05)；与模型组比较，相同时间点针刺组大鼠的GFAP、EGFR mRNA水平均明显降低，在第3天、7天呈现显著性差异(P<0.05)。见表5～6。

表5 各组大鼠不同时间点GFAP mRNA水平比较

表6 各组大鼠不同时间点EGFR mRNA水平比较

3 讨论

星形胶质细胞是中枢神经系统内含量最丰富的细胞，对神经元结构稳定起着支撑作用[15]。在正常生理条件下，星形胶质细胞为静止、活化两种细胞形态并存，而在脑出血等病理条件下，静息状态的星形胶质细胞可以迅速转变为活化状态，并分泌多种炎症细胞因子、细胞毒性因子等，诱导继发性脑损伤发生，阻碍神经元再生和神经功能恢复[9,16-17]。同时，星形胶质细胞过度增生形成的胶质瘢痕屏障，可对脑局部微血管产生压迫，影响局部脑血流供应[18]。因此，抑制脑出血后星形胶质细胞活化，并对其活化机制及调控因素进行深入研究，对于改善脑出血后继发性脑损伤，促进神经功能恢复有着重要的意义。

胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是星形胶质细胞的特异性分子标记物，在中枢神经系统损伤后多呈现高表达，以反应星型胶质细胞活化状态[11,19]。EGFR是一种特殊的跨膜糖蛋白，与自身配体结合后，可激活胞浆内酪氨酸蛋白激酶活性，并激活下游多条信号通路转导，刺激星形胶质细胞的分化与增殖[20-21]。已有研究发现，GFAP、EGFR在脑出血后血肿周围脑组织中长时间处于高表达状态，并主要定位于活化的星形胶质细胞中[11,22]，提示，二者可作为上游调控因子介导星形胶质细胞活化的信号转导。JAK/STAT通路是EGFR下游重要的信号传导通路之一，同时还是IFN、IL-6、ECF、EPO及TNF-α等多种细胞因子的反应性通路，各种细胞因子与细胞表面受体结合后，诱导受体上的酪氨酸残基磷酸化形成二聚体，使STAT离开受体转位到核内，结合DNA序列调控基因表达，从而介导多种病理过程中炎症、免疫反应的发生[11,23]。Leung YK等[24]研究发现，JAK/STAT通路可在脑损伤过程中被激活，参与调控并促进星形胶质细胞的分化、增殖。此外，由活化星形胶质细胞诱导的JAK/STAT信号通路介导的炎症反应，还可进一步加剧神经细胞损伤，阻碍神经功能恢复。STAT3是STAT蛋白家族成员之一，在GFAP启动子上有结合位点，可在激活后与其位点结合，引发酪氨酸的快速磷酸化和核转位，从而调控靶基因表达，诱导星形胶质细胞的活化、增生[25]。也有研究显示，STAT3是EGFR重要的下游效应分子，EGFR可通过磷酸化STAT3刺激星形胶质细胞活化，诱导神经细胞损伤[26]。

基于此，本研究采用针刺“百会”透“曲鬓”干预脑出血模型大鼠，探讨该方法对脑出血大鼠神经功能损伤及EGFR/STAT3通路的影响，为脑出血后干预星形胶质细胞活化提供新的治疗依据。脑出血在中医学中归属于“大厥”“薄厥”等疾病范畴，具体表现为薄仆而厥、人事不知、半身不遂和肢体不仁等症，病情进展迅速，症候错综复杂。头穴透刺作为一种独特的针刺治疗模式，用于治疗中风后神经功能障碍疗效显著，已得到世界医学界的公认。透刺法可通过一针跨多经多穴，统调各经穴之间的联系，扩大针刺治疗范围，加强针感扩散、传导，起到分别针刺两穴所达不到的治疗效果。笔者依据多年的临床实践证实，百会透曲鬓为治疗出血性脑卒中的较佳刺激区，百会居颠顶，归属督脉，为手足三阳、督脉之会，与脑联系密切，是调节脑功能的要穴；曲鬓穴位在头部，归属足少阳胆经，为足太阳、少阳之会。百会透曲鬓这一穴线横跨顶、额和营区，有督脉、足太阳膀胱经和足少阳胆经多条阳经贯穿，固刺激这一穴线具有统调一身阳气、醒脑开窍的作用。在前期的实验研究中业已证实，针刺“百会”透“曲鬓”治疗急性期ICH大鼠，能够明显改善大鼠继发性脑水肿和神经功能缺损症状，减轻炎性反应和氧化应激损伤，抑制神经细胞凋亡，具有明确的脑保护作用[27-29]。

本研究结果显示，百会透曲鬓干预后，针刺组大鼠在6 h、3 d和7 d时mNSS评分均较模型组降低，在3 d、7 d时差异有统计学意义(P<0.05)，并随时间呈明显下降趋势。免疫荧光显示，在7 d时针刺组大鼠GFAP、EGFR阳性细胞计数明显低于模型组(P<0.05)。Western blot和Real-time PCR结果可见，模型组、针刺组大鼠脑组织p-JAK1、p-STAT3蛋白表达和GFAP、EGFR mRNA水平均在脑出血后6 h出现明显增多，并持续升高，至3 d时达到峰值，7 d时可见下降，其中，针刺组大鼠在第6 h、3天及7天时的上述蛋白表达均较模型组降低，在第3天、7天时差异有统计学意义(P<0.05)。提示，百会透曲鬓能够降低血肿脑组织GFAP、EGFR、p-JAK1及p-STAT3等蛋白表达，并减轻脑出血大鼠神经功能损伤，该治疗作用可能是通过调控EGFR/STAT3通路抑制星形胶质细胞活化实现的。

综上所述，百会透曲鬓可通过调控EGFR/STAT3通路减轻脑出血大鼠神经功能损伤，在脑出血治疗中发挥脑保护作用。