薤白皂苷对冠心病模型大鼠心肌细胞凋亡及炎性因子、NF-κB表达的影响

温 亮，韩秀平，谢 燚，曹 建

冠状动脉粥样硬化性心脏病简称冠心病(coronary heart disease，CHD)，是临床较为常见的心血管疾病之一[1]。冠心病是指由于冠状动脉的粥样硬化导致其血管管腔发生狭窄、闭塞后引起的心肌缺血缺氧性病变，急性发作时可导致心肌坏死[2-3]。随着欧美发达国家二级预防措施及心脏康复的广泛普及，其冠心病的病死率已经出现了大幅度的下降，但我国缺血性心脏病正处于上升态势，严重影响我国居民的生活质量，因此，有效的治疗冠心病成为目前临床研究的重点。炎症在冠心病的发生、发展和预后过程中起着重要的作用[4]。冠心病病理过程的基础是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)，动脉粥样硬化发生的过程炎症贯穿其中，激活炎症反应会导致斑块不稳定，导致急性冠脉综合征的发生，通过体内炎症标志物水平的变化来反映局部和全身的炎症[5]。冠心病病人发生缺血事件时，炎症标志物的变化随其变化而变化，由此提示炎症标志物介导着冠心病的发生发展[6]。随着研究不断深入，人们发现核转录因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是各种炎性因子激活、级联放大的共同通道[7]。薤白为百合科多年生草本植物小根蒜的干燥鳞茎，现代研究显示，其治疗冠心病的物质基础为含氮化合物、含硫化合物及甾体皂苷，多数学者倾向于认为甾体皂苷是薤白发挥心血管作用的主要活性成分，甾体皂苷通过抑制血小板聚集、抗心肌缺血及抗再灌注损伤发挥作用[8-9]。但薤白皂苷对冠心病大鼠的治疗还没有明确的报道，因此，本研究采用薤白皂苷对冠心病大鼠模型进行干预，观察其对心肌细胞、炎症物质和NF-κB的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本实验所用动物为清洁级SD大鼠，均购自新疆医科大学附属第一医院实验动物研究部，动物合格证：SYXK(新)2014-0002，共计50只。鼠龄为8周，体质量220～240 g，大鼠室内环境保持光照12 h昼夜循环交替，自由进食饮水，大鼠适应新环境1周后用于后续实验，本研究经动物伦理委员会批准。

1.2 药品 将新鲜薤白鳞茎粉碎过16目筛，加入乙醇后经浸提、离心，提取上清液抽滤后经石油醚、正丁醇萃取，抽滤后得到薤白皂苷。垂体后叶注射液由上海第一生化药物有限公司生产。

1.3 试剂和仪器 兔抗NF-κB购自上海信裕生物科技有限公司，货号：bs-2695R；辣根过氧化物酶(DAB)显色试剂购自北京百奥莱博科技有限公司，货号：WE0323-HIS；NF-κB的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒购自上海BG生物工程公司；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；低温超速离心机购自德国Eppendorf公司；倒置显微镜购自日本Olympus公司；-20 ℃冰箱购自中国海尔集团；恒温箱购自宁波自动化仪表厂。

1.4 动物模型的建立及给药方法 建立冠心病大鼠模型，随机取10只大鼠给予正常饲料喂养，设定为正常组，剩余40只大鼠每只大鼠每天给予30 g高脂饲料(含77.3%普通饲料，10%猪油，10%蛋黄粉，2%胆固醇，0.2%丙硫氧嘧啶，0.5%胆酸钠)连续喂养6周，间隔24 h腹腔注射垂体后叶素30 μg/kg，连续3次。通过心电图鉴定是否成功建立冠心病大鼠模型，将40只成功构建冠心病模型的大鼠分为模型组、薤白皂苷低剂量组、薤白皂苷中剂量组和薤白皂苷高剂量组，每组10只。薤白皂苷低剂量组、中剂量组和高剂量组大鼠分别给予168 mg/kg、337 mg/kg和674 mg/kg的薤白皂苷灌胃，正常组和模型组大鼠分别给予等量的生理盐水灌胃，连续灌胃7 d。

1.5 收集标本 于大鼠尾静脉注入10%氯化钾注射液使心脏停搏于心室舒张期，立即取出大鼠的心脏，将心室分为心尖部和心底部，心尖部立即用液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存，用于蛋白检测。心底部位用4%多聚甲醛固定12 h后用于心肌细胞凋亡检测和组织病理检测。

1.6 血清炎性因子水平检测 采用ELISA法检测各组大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平，实验操作均按照ELISA试剂盒说明书严格操作。

1.7 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测心肌细胞凋亡 取出大鼠的心肌组织，分别切成0.5 cm的块状，固定后石蜡包埋，将组织切片。用TUNEL法将石蜡切片进行染色，所有的步骤按照试剂盒上的说明严格进行。每张石蜡切片选取5个不交叉的视野进行观察，凋亡的心肌细胞为深棕色。细胞凋亡率=细胞凋亡数量/细胞总数×100%。

1.8 心肌组织病理学形态观察 制备心肌组织切片，每个样本取不连续3张切片，常规脱蜡至水，苏木精液染色、75%盐酸乙醇分化、氨水处理、酸化伊红乙醇染色处理后水洗、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固，光镜下观察。

1.9 蛋白质印记法检测大鼠NF-κB蛋白表达 分别提取各组大鼠的心肌组织100 mg，进行裂解并提取核蛋白，并测量核蛋白浓度，分装存于-20 ℃的环境中。蛋白溶液：缓冲溶液为4∶1混合，然后将其煮沸、蛋白质变性。取50 μm的注入蛋白样品电泳板内，把电泳后的样品转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，加入脱脂奶粉，并进行封闭，时长为1 h。加入一抗后进行TTBS漂洗，每次漂洗10 min，共进行3次漂洗，最后加入二抗对溶液进行稀释，再在常温环境中封闭1 h。取出PVDF膜，TTBS漂洗10 min×3次，DAB显色后采用数码相机照相。

2 结 果

2.1 各组血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平比较 模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平较正常组明显升高(P<0.05)；与模型组比较，薤白皂苷低剂量组、薤白皂苷中剂量组和薤白皂苷高剂量组TNF-α、IL-1β和IL-6水平明显降低，且TNF-α、IL-1β和IL-6水平逐渐递减，薤白皂苷高剂量组TNF-α、IL-1β和IL-6水平低于薤白皂苷低剂量组、薤白皂苷中剂量组(P<0.05)。详见表1。

表1 各组血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平比较 单位：ng/mL

2.2 各组血浆NF-κB浓度比较 与正常组比较，模型组血浆NF-κB浓度明显增加(P<0.05)；与模型组比较，薤白皂苷低剂量组、薤白皂苷中剂量组和薤白皂苷高剂量组血浆NF-κB浓度明显降低(P<0.05)，且随着薤白皂苷剂量越高NF-κB浓度越低(P<0.05)。详见表2及图1。

表2 各组大鼠血浆NF-κB浓度比较 单位：ng/mL

与正常组比较，＊P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与薤白皂苷低剂量组比较，△P<0.05；与薤白皂苷中剂量组比较，☆P<0.05。

2.3 各组大鼠心肌细胞凋亡率比较 与正常组比较，模型组心肌细胞凋亡率明显升高(P<0.05)；与模型组比较，薤白皂苷低剂量组、薤白皂苷中剂量组和薤白皂苷高剂量组心肌细胞凋亡率均明显降低，且薤白皂苷高剂量组心肌细胞凋亡率低于薤白皂苷低剂量组、薤白皂苷中剂量组(P<0.05)。详见表3及图2、图3。

表3 各组大鼠心肌细胞凋亡率比较 单位：%

与正常组比较，＊P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与薤白皂苷低剂量组比较，△P<0.05；与薤白皂苷中剂量组比较，☆P<0.05。

图3 各组大鼠心肌细胞凋亡TUNEL染色荧光图(×400)

2.4 各组大鼠心肌组织病理学变化 正常组大鼠心肌细胞排列整齐，大小正常，边界清楚，胞浆均匀，胞核染色均匀，间质成纤维细胞形态无异常；血管厚度正常，血管周围胶原沉积少，无炎症细胞浸润；与正常组比较，模型组大鼠心肌细胞明显肥大增厚，细胞浆呈浓染，增大，细胞间距增大，单位面积内心肌细胞数较正常组明显减少，血管壁增厚，血管周围有较多胶质沉淀，出现大量的炎症细胞浸润。薤白皂苷低剂量组、薤白皂苷中剂量组和薤白皂苷高剂量组血管周围胶原沉积和心肌炎症细胞浸润均明显减少，心肌组织得到了明显的改善，且改善程度呈剂量依赖性，薤白皂苷高剂量组>薤白皂苷中剂量组>薤白皂苷低剂量组。详见图4。

图4 各组大鼠心肌组织HE染色(×400)

2.5 各组大鼠心肌组织中NF-κB蛋白表达比较 模型组和正常组NF-κB蛋白表达比较明显升高(P<0.05)；与模型组比较，薤白皂苷低剂量组、薤白皂苷中剂量组和薤白皂苷高剂量组大鼠心肌细胞中NF-κB蛋白表达明显降低，且随着薤白皂苷剂量增加NF-κB蛋白表达降低(P<0.05)。详见图5、图6。

图5 各组大鼠心肌组织中NF-κB蛋白表达条带图

与正常组比较，＊P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与薤白皂苷低剂量组比较，△P<0.05；与薤白皂苷中剂量组比较，☆P<0.05。

3 讨 论

冠心病是常见的危害人类健康的疾病之一，动脉粥样硬化、血管再狭窄和心肌缺血再灌注损伤影响着冠心病的发生发展[10]。近年来的基础研究显示，心肌细胞凋亡在动脉粥样硬化、血管再狭窄、急性心肌梗死、心肌缺血、再灌注损伤的发展中可能起着重要的作用[11]。细胞凋亡又称为程序性细胞坏死，是多细胞生物体细胞自我有效消亡过程。细胞凋亡和细胞坏死在形态上大不相同，属于另外一种细胞死亡的类型[12]。近年来，随着对冠心病发病机制的深入研究，细胞凋亡与冠心病的关系研究成为热点之一。有研究证实心肌缺血是心肌细胞坏死和凋亡的重要因素，心肌缺血引起细胞色素释放及活化介导的细胞凋亡机制[13]。本研究结果显示，与正常组比较，模型组心肌细胞凋亡率明显升高；采用不同剂量的薤白皂苷干预后发现，冠心病大鼠心肌细胞凋亡率得到了明显的抑制，且随着薤白皂苷剂量增加，心肌细胞凋亡率逐渐降低，可见薤白皂苷可有效抑制心肌细胞凋亡。

中药薤白为葱科植物小根蒜的鳞茎，具有通阳散结、行气止痛的功效，薤白是我国传统的中药汤剂瓜蒌薤白白酒汤、瓜蒌薤白半夏汤、枳实薤白桂枝汤的经典配伍方药[14-15]。其次，作为一种药食同源的植物，薤白因其历史悠久、具有更高的安全性及较少的毒副作用而受到亚洲国家人民的普遍欢迎和广泛使用。现代研究表明，薤白含有多种药理活性成分，具有抗菌消炎、解痉平喘、抗肿瘤、降血脂、抗动脉粥样硬化等作用[16]。薛慧文等[15]体外实验发现，薤白通过抑制Ca2+超载可对过氧化氢(H2O2)诱导的心肌细胞氧化应激损伤发挥保护作用。

动脉粥样硬化是冠心病的病理基础，其病灶深处含有脂质和坏死成分的脂核，上覆以突出于血管腔面的纤维帽，随着病程的进展，斑块可有纤维帽溃疡破裂、斑块内出血、斑块钙化等继发改变，而炎性因子在高血压、血脂代谢异常等心血管危险因素作用下影响动脉粥样硬化的发生与进展[17]。临床研究表明，冠心病病人血清促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6升高。本研究发现，模型组血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平高于正常组，薤白皂苷各剂量组血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平低于模型组，且随着薤白皂苷剂量的增加，血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平逐渐降低，提示薤白皂苷可减轻冠心病大鼠的炎症反应。刘泽君等[18]研究证实薤白皂苷化合物可能具有抗血小板相关炎症的作用。

NF-κB作为一种炎症反应调节因子，广泛存在于血管内皮细胞、平滑肌细胞、单核巨噬细胞和淋巴细胞内，调控着一系列的有关炎症反应、免疫答应、细胞生长、发育等一些细胞基因的表达，NF-κB介导着一些心血管疾病的生理过程，如动脉粥样硬化、冠心病等。在这些疾病致病过程中，均可发现NF-κB呈过度激活状态，大量胞浆内的NF-κB复合物移位进入细胞核内，诱导前炎症介质和免疫相关基因的转录与表达[19]。本研究结果显示，模型组血浆NF-κB浓度和蛋白表达均明显升高，薤白皂苷低剂量组、薤白皂苷中剂量组和薤白皂苷高剂量组NF-κB浓度和蛋白表达均明显低于模型组，提示不同剂量的薤白皂苷可有效抑制NF-κB表达，且随着薤白皂苷剂量的增加，NF-κB表达逐渐降低。崔翔[20]研究证实，心功能指标降低，NF-κB的表达升高，且NF-κB随着心脏结构指标降低而降低，推测NF-κB介导着冠心病心力衰竭的发生发展。

综上所述，薤白皂苷可有效抑制冠心病大鼠心肌细胞凋亡，减缓炎症反应，同时抑制NF-κB蛋白表达。