精子DNA碎片指数对首次IUI临床结局的影响

周文，周欢群，李思楠，陈旭龙，谢妍，倪运萍，陆杉

目前男性不育的诊断是基于WHO第五版定义的精液常规参数，如精液量、浓度、活力、总数及形态等，但对男性不育的诊疗价值有限。精子DNA碎片在自然妊娠和辅助生殖中对受精、胚胎发育和父方遗传信息传递都有重要影响[1]。精子DNA碎片是评估男性不育非常有价值的工具，但在预测辅助生殖技术结局方面的临床意义仍不确定。关于精子DNA碎片指数(DNA fragmentation index，DFI)与辅助生殖结局的关联，报道集中于体外受精(in vitro fertilization，IVF)、卵胞浆内单精子注射(intracytoplasm sperm injection，ICSI)，对宫腔内人工授精(intrauterine insemination，IUI)的报道较少，精子DFI对IUI临床结局的预测价值存在较大的争议，且难以确定预测IUI结果的阈值[2]。其次，关注点主要集中于精子DFI对IUI临床妊娠率、自然流产的影响[3]，而与活产率、新生儿身长、体重相关性的报道较少。本研究对广东省中医院生殖医学科近4年完成的首次IUI临床结局资料及术前3个月内的精子DFI数据进行回顾性分析，主要探讨精子DFI对IUI临床妊娠率、流产率、活产率及新生儿指标的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

对2016年12月至2020年2月广东省中医院生殖医学科完成的首次IUI周期的临床结局资料及术前3个月内的精子DFI数据进行回顾性分析，纳入条件：① 女性为第一个IUI周期，且丈夫术前3个月内完成了精子DFI筛查(SCD法)；② 20岁<女性年龄<45岁；③ 临床结局资料随访至分娩，资料完善。排除条件：① 排除SCSA法、TUNEL法、Comet法检测精子DFI的患者；② 排除优化后PR精子总数<2×106/mL的患者；③ 排除严重精神疾病及其他系统性疾病的患者。最终纳入393例女性，年龄22～43岁，平均(30.91±1.79)岁；平均不孕年限(3.19±1.79)年；平均体质量指数(body mass index，BMI)(21.98±3.31) kg/m2。根据丈夫精子DFI分为以下两组：DFI<30%组(318例)，DFI≥30%组(75例)，两组男方年龄、女方年龄、女方BMI、不孕因素、流产史、处理后PR精子总数等一般资料有可比性(P>0.05)，详见下页表1。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集

(1)一般资料收集：从生殖医学科IUI病历系统收集患者首次IUI时的年龄、不孕年限、不孕因素、BMI、流产史、方案及精液优化结果等临床资料。

(2)IUI临床结局资料收集：所有患者随访至分娩。从生殖医学科IUI病历系统随访模块收集患者首次IUI的临床结局资料，包括临床妊娠、生化妊娠、自然流产、异位妊娠、早产、活产、出生体重、出生身长、出生缺陷等。计算公式：临床妊娠率=临床妊娠周期数/总周期数×100%，自然流产率=自然流产周期数/临床妊娠周期数×100%，活产率=活产周期数/总周期数×100%。

(3)IUI治疗方案：

① 自然周期：监测卵泡发育；确定排卵日及选择夫精人工授精(artificial insemination by husband，AIH)时机：当主导卵泡直径达16～20 mm，血E2达到900～1 110 pmol/L(270～300 pg/mL)，出现尿黄体生成素(luteinizing hormone，LH)峰或血LH水平上升到大于基础值2倍以上，12～36 h后行AIH。未出现尿LH峰或血LH水平未达到基础值2倍以上，使用人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)5 000～10 000 U肌注诱导排卵，24～36 h后行AIH。

② 促排卵周期：促排卵方案包括：克罗米芬(clomiphene citrate，CC)/来曲唑+hCG、CC/来曲唑+人绝经期促性腺激素(human menopausal gonadotropin，hMG)+hCG、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)/hMG +hCG。卵泡生长及子宫内膜监测：B超监测卵泡发育情况及子宫内膜的同步增长情况。注射hCG及AIH时机的选择：若1个卵泡直径≥18 mm，或2个卵泡直径≥17 mm，停用Gn，若未出现尿LH峰或血LH水平未达到基础值2倍以上，注射hCG10 000 U或GnRHa诱导排卵，24～36 h后行AIH；若前1天晚上尿中出现LH峰值，当日上午B超监测未排卵，当日上午注射hCG 10 000 U并行AIH 1次；若当日晨尿中出现LH峰值，当日上午B超监测未排卵，当日上午注射hCG10 000 U，当日下午行AIH。

③ 精液优化：密度梯度离心法优化精液，处理后精子重悬于0.3～0.5 mL G-VIF中备用。

④ IUI：人工授精管接注射器，吸取经洗涤优化处理的精液0.3～0.5 mL，超声引导下通过宫颈将人工授精导管插入宫腔，缓慢将精液推注宫腔。

⑤ 术后监测及处理：术后14～16 d，行尿妊娠试验检查或测血hCG水平。阳性者在术后30～35 d行B超检查受孕情况。黄体功能不足者行黄体支持。

⑥ 随访时间：人工授精术后14～16 d、术后30～35 d、术后50 d、孕12周、分娩后。

1.2.2 精子DFI检测(SCD法) 收集患者首次IUI术前3个月内的精子DFI数据。精子DFI均采用染色质扩散法(SCD法)检测，试剂盒为深圳华康精子核DNA完整性检测试剂盒(SCD法)，主要步骤包括：制片、变性、裂解、脱水、染色、阅片等。于1 000×油镜下分别计数大晕环、中晕环、小晕环、无晕环精子数，总数不少于400条。精子DFI=(小晕环精子数+无晕环精子数)/计数精子总数×100%。

1.3 评价指标

1.3.1 比较DFI<30%组与DFI≥30%组患者的临床资料 包括男女方年龄、不孕年限、不孕因素、原发/继发不孕、女方BMI、流产史、自然/促排卵周期、处理后PR总数等指标。

1.3.2 比较DFI<30%组与DFI≥30%组患者的IUI临床结局 包括临床妊娠率、生化妊娠率、自然流产率、活产率、新生儿体重、新生儿身长等指标。

1.3.3 比较妊娠组与未妊娠组、活产组与未活产组患者的精子DFI。

1.3.4 ROC曲线分析精子DFI对IUI妊娠、活产的预测价值。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 两组临床资料比较

两组患者男方年龄、女方年龄、女方BMI、不孕年限、不孕因素、原发性不育/继发性不育、流产史、自然/促排卵周期、处理后PR精子总数比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，详见表1。

表1 两组临床资料比较

2.2 精子DFI对IUI临床结局的影响

两组临床妊娠率、自然流产率、活产率、出生体重、出生身长比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。DFI<30%组生化妊娠7例、异位妊娠1例、早产3例、出生缺陷0例，DFI≥30%组生化妊娠0例、异位妊娠0例、早产0例、出生缺陷1例，样本量太少，未进行统计学分析，详见表2。

表2 精子DFI对IUI临床结局的影响

2.3 妊娠组、活产组精子DFI分析

妊娠组与未妊娠组精子DFI比较，差异无统计学意义(P>0.05)。活产组与未活产组精子DFI比较，差异亦无统计学意义(P>0.05)，详见表3。

表3 妊娠、活产组精子DFI分析

2.4 精子DFI对IUI临床结局的预测价值分析

通过ROC曲线分析精子DFI对IUI临床结局的预测价值，结果显示精子DFI不能预测IUI临床妊娠(AUC=0.521，P=0.611，95%CI：0.439-0.603)或活产(AUC=0.502，P=0.985，95%CI：0.331-0.673)，详见下页图1。

A：精子DFI预测IUI临床妊娠；B：精子DFI预测IUI活产

3 讨论

精子DNA碎片发生于精子发生和成熟的过程中[4]。受体内、外界多种因素的影响，精子细胞染色体和DNA完整性受损，导致DNA片段化。目前已知导致精子DNA损伤的主要因素有3个：精子染色质组装异常、精子细胞异常凋亡和过度氧化应激[4]。精子DNA损伤影响精子受精能力及胚胎发育潜能，已知高精子DFI男性生育力下降及伴侣自然流产率明显升高[5]。目前，精子DFI在预测IUI临床结局的意义仍不明确，文献报道存在较大差异；可能与低质量的证据有关，包括有缺陷的研究设计、有限的研究规模或潜在的混杂因素等。

关于精子DFI与IUI临床结局关联的报道较少，其中大部分研究认为精子DFI对IUI临床结局没有显著影响。Yang H等[6]对1 185个IUI周期进行回顾分析，结果显示DFI>30%、15%30%三组的IUI临床妊娠率、流产率、活产率差异无统计学意义。Siddhartha N等[8]对105例行IUI治疗的不育男性进行DFI检测，结果显示DFI≥20%与DFI<20%组IUI临床妊娠率差异无统计学意义。Muriel L等[9]对100个IUI周期进行研究，未发现精子DFI与IUI临床妊娠率之间的相关性。Vandekerckhove FW等[10]对25例不明原因不育男性精子DFI进行分析，结果显示精子DFI不能预测首次IUI的临床妊娠率及活产率。相反，少部分研究认为精子DFI对IUI临床结局有显著影响。Bungum M等[11]对387个IUI周期的研究显示DFI> 30%组的生化妊娠、临床妊娠和活产显著低于DFI≤30%的夫妇。曹晓敏等[12]对88个IUI周期的研究显示未妊娠组精子DFI显著升高。杨晓玉等[13]对428个IUI周期的研究显示DFI>25%的患者IUI妊娠率明显低于DFI≤25%的患者。本研究结果显示，DFI≥30%组与DFI<30%组临床妊娠率、自然流产率、活产率比较，差异均无统计学意义，与相关文献[6-10]报道一致，但与部分文献[11-13]存在差异。可能原因为混杂因素的影响、精子DFI检测方法的差异、单次IUI结局与累计结局的差异以及样本量的影响。以上多数报道存在较多混杂因素，如女方因素、女方年龄、处理后PR总数等，本研究中两组的一般资料具有可比性，减少了部分混杂因素的影响。本研究采用SCD法检测精子DFI，而文献主要采用SCSA法[6-7,11,13]、部分采用SCD法[9-10,12]、TUNEL法[8]，及在各个实验室的检测流程均可能导致数据偏倚[14]，影响统计结果。绝大多数研究[6,8,11,13]统计了入组患者的多个周期的累计妊娠及流产情况，而本研究仅对首次IUI结局进行统计，减少周期累计变量导致结局改善的影响，相关文献也统计了首次IUI结局，研究结果与本研究类似[7,10]。

本研究中DFI≥30%组与DFI<30%组出生婴儿体重、身长比较，差异均无统计学意义。刘玉林等[15]对4 080个IVF/ICSI周期分娩结局的研究显示，精子DFI升高可导致IVF/ICSI优胚率降低，但不影响新鲜周期的早产率、新生儿体重以及出生缺陷率。Bungum M等[16]对131例IVF/ICSI出生子代的健康与发育进行分析，结果显示高精子DFI对新生儿体重、孕周没有明显影响。以往认为IUI是辅助生殖技术中最接近于自然妊娠的一种手段，因此对IUI后代健康及发育的跟踪随访较少，几乎未见精子DFI对IUI子代影响的报道，结合以上两篇IVF/ICSI的报道及本研究的结果，预测精子DFI对IUI新生儿体重、新生儿身长应无明显影响，未来应加大样本量进行研究验证。本研究还发现DFI<30%组异位妊娠1例、早产3例、出生缺陷0例，DFI≥30%组异位妊娠0例、早产0例、出生缺陷1例，但由于样本量太少，数据未能进行统计学分析，因此对于异位妊娠、早产、出生缺陷的比较还需更大样本量的研究。综上所述，本研究发现精子DFI≥30%对IUI临床结局没有显著影响，可能原因为密度梯度离心可剔除部分高DFI精子，显著降低处理后精液中的DFI，从而降低DFI差异对IUI结局的影响。此外，本研究分别对妊娠组/未妊娠组、活产组/未活产组的精子DFI进行比较，差异无统计学意义，也提示IUI妊娠及活产与精子DFI无明显关联；ROC曲线显示精子DFI不能预测临床妊娠及活产。

本研究存在以下优势，即仅对首次IUI周期临床结局进行分析，排除累计妊娠结局对统计的影响。此外，还对活产率、胎儿体重身长等指标进行统计，从分娩数据分析DFI对IUI结局的影响。SCSA法虽然是检测精子DFI的金标准，但仍存在局限性，如目标细胞群的选择、门的设置及结果计算仍存在一些争议[15]，而SCD法结果评估直观简单，虽然存在主观性，但在质控充分的基础上也可保证结果的准确性。然而，本研究的不足主要为样本量偏少可能影响统计结果，尤其是流产、活产的统计结果，样本量少也使得异位妊娠、早产、先天畸形等指标无法统计。尽管本研究中高DFI与低DFI组的一般资料差异无统计学意义，但并未细分混杂因素，例如男方因素、女方因素的具体病因以及促排卵方案的具体策略等。

综上所述，本研究证实了高精子DFI对IUI临床妊娠、自然流产、活产及部分新生儿指标无明显影响。未来将对更多的IUI周期数进行统计，包括单次周期及重复周期，分别探讨DFI对首次IUI结局及累计IUI结局的影响。此外，术前3个月内的DFI数据难以反映IUI手术时的DFI，未来将考虑分析IUI前后的DFI与妊娠结局的关联，通过增加样本量深入研究精子DFI预测IUI临床分娩结局的价值及可能的截取值。