分子印迹光子晶体传感器的制备及其对酒类食品中邻苯二甲酸二丁酯的快速检测

张 鑫，马艺涵，崔雨桐，毛嘉悦，姚云剑

（1.南阳师范学院生命科学与农业工程学院，河南 南阳 473061；2.农业生物质资源化河南省高校工程技术研究中心，河南 南阳 473061）

食品以及食品包装的有害物质检测已经成为食品安全管理的重要部分。邻苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）是一种环境内分泌干扰物，在工业上广泛用作塑化剂，可以通过食品包装材料接触、土壤-水-土壤之间等多种途径迁移进入人体和环境地表水中，给人类和自然环境带来极大的危害。近些年，我国塑化剂含量超标引发的食品安全问题屡次发生。如2011年中国台湾地区曝出“起云剂”事件，某知名白酒被报道产品中DBP严重超标，引发社会对食品安全的极大关注。目前，已经有多种技术手段用于邻苯二甲酸酯类塑化剂的检测，如高效液相色谱法、气相色谱法、质谱、液相色谱-质谱、电化学法、化学/生物传感器等。然而，这些方法虽然可以准确测定目标分析物的含量，但是要求精密仪器设备以及专业技术人员，并不适合现场的快速筛查分析以及消费者使用。因此，开发一种操作简单、成本低廉的塑化剂检测方法极其必要。

光子晶体是由介电常数（折射率）不同的材料按固定周期顺序排列而形成的晶体结构。利用光子晶体凝胶体积收缩或膨胀的变化引起的晶格参数和介电常数的变化，可以设计体积小、易合成、灵敏度高的新型传感器元件。当光子晶体的结构参数发生变化，可以通过其衍射峰位移或者峰强度的变化表达其对目标分析物的响应。在一定条件下，还可以通过光子晶体的结构色变化，实现裸眼判别对目标分析物。分子印迹技术是指构建对模板分子在大小、形状、以及功能基团互补的受体的一种技术。在洗脱模板分子后，制备得到与模板分子具有互补结合位点的分子印迹聚合物，具有选择性高、成本低廉以及机械性高的优点。Zhou Zhipin等制备了基于二氧化硅包覆的锰掺杂的硫化锌量子点荧光分子印迹传感器，成功用于自来水中DBP的检测，其检测限为0.04 μmol/L。李颖等制备了金修饰的磁性石墨烯分子印迹聚合物膜，用于水中DBP的分析检测，对DBP的相应时间为6 min，检出限为0.349 nmol/L。Chen Shan等采用溶胶-凝胶聚合方法制备了基于CdTe量子点和咪唑酸沸石骨架-67的近红外荧光分子印迹传感器，用于食品中DBP的高选择性、高灵敏检测。Wang Shan等采用表面分子印迹技术，以羧基化的二氧化硅微载体制备了DBP的分子印迹电化学传感器，并通过多壁碳纳米管和金纳米粒子改善了探针的选择性，为复杂样品中的DBP检测提供一种有效地电化学检测方法。这些研究表明分子印迹技术在DBP检测中具有很好的应用前景，而将分子印迹技术与光子晶体技术结合，可以构建DBP分子印迹光子晶体传感器。相比于其他DBP的检测方法，分子印迹光子晶体传感器利用分子印迹的高选择性捕获样品中的DBP分子，同时将DBP的分子识别转换为光学信号，响应时间快，操作更简单，选择性高，是一种理想的DBP的检测方法。

基于此，本研究将光子晶体的光学特性与分子印迹的选择性结合，以邻苯二甲酸二丁酯为模板分子，构建具有反蛋白石结构的分子印迹光子晶体凝胶膜（molecularly imprinted photonic hydrogels，MIPHs）用于DBP的快速识别分析。本方法不仅保留了分子印迹的高选择性也改变传统的MIPs传质慢、洗脱难等问题，同时也拓宽了光子晶体的应用范围。制备的DBP分子印迹光子晶体传感器成本低、操作简单方便，可以多次重复使用，通过简单洗脱即可连续化操作，有利于现场实时在线检测酒类中的微量DBP分子，具有广阔的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

二甲基丙烯酸乙二醇酯（ethyleneglycol dimethacrylate，EGDMA）、甲基丙烯酸（methacrylic acid，MAA） 北京百灵威科技有限公司；正硅酸乙酯（tetraethoxysilane，TEOS）、偶氮二异丁腈（azobisisobutyronitrile，AIBN）、DBP、邻苯二甲酸（phthalic acid，PA）、邻苯二甲酸二甲酯（dimethyl phthalate，DP）、邻氨基苯甲酸甲酯（methyl anthranilate，MA） 上海麦克林生化科技有限公司；浓硫酸（纯度为98%）、氢氟酸（hydrofluoric acid，HF，40%） 洛阳昊华化学试剂有限公司；甲醇、无水乙醇、乙酸（纯度均为99%） 天津市科密欧化学试剂有限公司。以上试剂均为分析纯，实验用水均为超纯水。

1.2 仪器与设备

SB-5200超声波清洗仪 宁波新芝生物科技股份有限公司；SPECORD高精密紫外分光光度计 德国耶拿仪器有限公司；101恒温鼓风干燥器 北京中兴伟业仪器有限公司；Sigma 500/VP场发射扫描电镜 德国卡尔蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 单分散SiO微球的合成

单分散二氧化硅微球的制备过程如下：首先，将10 mL浓氨水（28%）、16.25 mL乙醇以及24.75 mL水依次加入到烧杯中1 200 r/min搅拌；其次，4.5 mL TEOS和45.5 mL无水乙醇快速加入，混合均匀后，室温下360 r/min反应2 h；最后，离心收集后乙醇清洗3 次除去未反应物，保存备用。

1.3.2 DBP分子印迹光子晶体凝胶膜的制备

将硅片清洗后裁剪为76 mmh12 mm，置入HSO-HO（9∶1，/）中浸泡24 h，然后纯水清洗，氮气吹干备用。定制厚度为1 mm的25 mmh10 mm的聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）膜片备用。筛选粒径为240 nm单分散二氧化硅微球，采用垂直自组装法制备光子晶体模板。反蛋白石结构的分子印迹光子晶体凝胶膜制备参考相关文献方法并作一定改进。过程如图1所示，首先，将模板分子（DBP，0.1 g）和功能单体（MAA，0.50 mL）溶于2.0 mL无水甲醇中，超声分散后加入交联剂（EDGMA，0.58 mL），混匀后加入2.7 mg AIBN得到预聚合溶液；其次，采用后填充技术，将上述溶液缓慢注入光子晶体与PMMA间的缝隙，同时固定两侧给予压力，保证MIPHs的成型，将硅片置于波长365 nm紫外光下引发聚合3 h后静置反应12 h；最后，待聚合反应完成后，将上述硅片浸入2.5%氢氟酸溶液中刻蚀去除光子晶体模板，即得到反蛋白石结构的MIPHs。构建的DBP分子印迹光子晶体膜用甲醇-乙酸（9∶1，/）洗脱剂去除模板分子，作为对照，非印迹光子晶体聚合物膜（non-imprinted photonic hydrogels，NIPHs）除不加入模板分子外，其余制备步骤一致。

图1 分子印迹光子晶体凝胶膜的制备示意图Fig.1 Schematic of preparation of MIPHs

1.3.3 DBP分子印迹光子晶体膜制备条件优化

为了能够顺利引发聚合，同时保证下一步刻蚀时聚合膜的完整性，分别改变了MAA、EGDMA和AIBN的用量，探究制备MIPHs的最优条件。具体过程如下：固定模板DBP用量，考察不同功能单体MAA和交联剂EGDMA用量比例对制备的MIPH的性能影响。在进行模板的刻蚀时，为了保证能够完全刻蚀除去二氧化硅微球，留下完整的反蛋白石结构空穴，实验考察不同质量分数的氢氟酸（1.0%、2.5%、3.0%、4.0%、5.0%）以及刻蚀时间对制备过程的影响。选用不同洗脱溶剂，筛选最佳洗脱条件。

1.3.4 制备的DBP分子印迹光子晶体膜性能测定

分别将制备的DBP分子印迹光子晶体膜和非印迹膜置入0.1 mg/L的DBP溶液中，测定不同时间下光谱变化，记录峰位移量与时间的变化曲线。将制备的MIPHs和NIPHs分别置入10 mL不同质量浓度（0.01～0.5 mg/L）的DBP溶液中，25 ℃反应3 min，测定其对DBP的吸附量变化。MIPHs和NIPHs对DBP吸附量（，mg/g）按式（1）计算：

式中：和分别为初始和吸附平衡时样品中DBP的质量浓度/（mg/mL）；为样品溶液的体积/mL；为MIPHs和NIPHs的质量/g。

1.3.5 选择性实验

选用PA、MA作为DBP的结构类似物进行选择性实验。将制备的MIPHs和NIPHs分别置入一系列质量浓度（0.01～0.5 mg/L）的样品溶液中，测定其衍射峰位移变化。

1.3.6 实际样品分析

将制备的MIPHs传感器用于实际样品中DBP检测分析。实际样品选用超市售白酒，样品经滤膜（0.45 μm）过滤后，将制备的MIPHs置入不同样品后测定其光谱变化，记录峰位移量。为了进一步评价传感器的检测性能，实验采用标准加入法在实际样品中加入DBP标准品，测定加标前后MIPHs的峰位移量变化。

2 结果与分析

2.1 DBP分子印迹光子晶体凝胶膜的制备

采用扫描电子显微镜对制备的光子晶体模板和分子印迹光子晶体凝胶膜进行形态与结构分析，结果如图2所示。制备光子晶体模板电镜图显示光子晶体模板上的二氧化硅微球紧密排列，SiO微球之间有序排列，为后续分子印迹聚合物的填充提供了充分条件。制备光子晶体模板的最大衍射峰波长应位于480 nm左右。实验结果表明，制备的光子晶体膜的特征峰为486 nm，呈青绿色，符合理论计算结果。

MIPPHs的制备是将预聚合溶液在毛细管压力的作用下均匀充满光子晶体模板孔隙聚合，然后采用HF溶液刻蚀去除模板，得到反蛋白石结构分子印迹光子晶体凝胶膜。由图2B可知，成功刻蚀去除光子晶体模板后，得到由分子印迹聚合物构成支撑的反蛋白石多孔网状结构，制备的MIPHs空穴均一，直径约为220 nm左右，呈多层有序排列。制备MIPPHs洗脱去除模板分子（DBP）后，即可形成与DBP分子在功能基团、大小、形状上互补的印迹空穴，特异结合DBP分子，从而改变MIPPHs膜上孔穴结构变化，导致MIPPHs的衍射峰位移发生变化，利用这一点可以实现对样品中DBP分子特异识别检测。

图2 光子晶体模板（A）和反蛋白石结构分子印迹凝胶膜（B）的扫描电镜图Fig.2 SEM images of photonic crystal templates (A) and molecularly imprinted inverse opal photonic hydrogels (B)

2.2 MIPPHs制备条件的优化

实验进一步对MPPHs的制备体系进行优化，结果如图3所示。实验结果表明，在DBP用量一定的条件下，当功能单体MAA与交联剂EGDMA 的物质的量比为2∶1时，制备的MIPPHs对DBP具有光谱响应最明显。此外，刻蚀效果直接影响制备的MIPHs上的孔穴结构，实验对光子晶体模板刻蚀条件进行考察。当溶液中HF质量分数较低时，会导致刻蚀不完全，而过高的HF质量分数会造成PMMA快速脱落，MIPHs膜分布不均。最终实验确定最佳刻蚀条件为质量分数2.5% HF溶液滴加刻蚀3.0 h效果最好。在进行膜上模板分子洗脱时，甲醇和乙酸能够破坏化学键的极性，使氢键断裂，模板DBP分子溶于甲醇中，留下空穴和特异性识别位点再次结合模板分子。因此，实验选择不同洗脱体系进行模板分子的洗脱体系：甲醇-乙酸、甲醇-水-乙酸、乙酸溶液，考察MIPHs在不同洗脱体系下模板分子的洗脱效果。当选用不同体积分数、不同物质构建洗脱体系时，分子印迹膜与模板分子的洗脱效果有显著差异，最终采用甲醇-乙酸（9∶1，/）作为洗脱溶剂。

图3 功能单体（MAA）与交联剂（EGDMA）用量比例对MIPHs峰位移的影响Fig.3 Effect of ratio between MAA and EGDMA on diffraction peak displacement of MIPHs

2.3 MIPPH对DBP的吸附性能

2.3.1 吸附动力学

将制备的MIPHs置入0.1 mg/L DBP溶液中，测定其随时间的特征峰位移量变化，结果如图4所示。由图4可知，在最初0～3 min内，MIPPHs的特征峰位移量迅速增大，在吸附反应3 min后，MIPPHs的特征峰位移量趋于稳定，表明对DBP的吸附达到平衡。结果表明，制备的MIPPHs能够对DBP分子具有快速响应能力，在3 min时即可达到DBP的吸附平衡。

图4 反应时间对制备MIPHs和NIPHs衍射峰位移的影响Fig.4 Effect of reaction time on diffraction peak displacement of MIPHs and NIPHs

2.3.2 吸附等温线

测定制备的MIPPHs对DBP的吸附等温线，评价MIPPHs对DBP的吸附性能。由图5A可知，MIPPH对DBP吸附量随着样品溶液中DBP浓度的升高而增加，且MIPPHs对DBP的吸附量明显高于NIPPHs。这是由于MIPPHs上存在3D-印迹空穴，更易于DBP分子进入膜内，特异吸附结合DBP分子，表现出对DBP较高的吸附量。相反，NIPPHs上没有印迹位点，通过非特异性吸附结合DBP分子。采用Scatchard方程对分子印迹光子晶体对DBP的吸附数据进行拟合分析，Scatchard方程如下：

式中：为平衡时MIP对DBP的结合量/（mg/g）；为平衡时游离DBP的质量浓度/（mg/L）；为MIP对DBP的最大结合量/（mg/g）；为平衡时的解离常数。

由图5B可知，Scatchard分析结果得到2 条不同斜率的直线，表明制备的分子印迹光子晶体对DBP具有2 种结合位点，其拟合方程分别为/＝5.10－0.052 3（＝0.980 3）和/＝2.021 0－0.345 0（＝0.980 7）。

图5 MIPHs对DBP吸附平衡等温线（A）和 Scatchard拟合分析（B）Fig.5 Adsorption isotherms (A) and Scatchard fitting curves (B) of MIPHs for DBP

2.4 MIPPHs对DBP的传感分析

由图6可知，当与溶液中DBP分子结合后，制备MIPHs发生明显红移，波长移动到535 nm，而未结合DBP分子时，衍射峰位于503 nm，位移大小为32 nm，这主要是因为制备的MIPPHs上存在DBP分子印迹空穴，可以选择性捕获溶液中的DBP分子，DBP吸附结合量大，在非共价作用力的作用下结构发生改变，形成明显位移变化。而当洗脱去除膜上结合的DBP后，其衍射峰又恢复到500 nm左右。作为对照，NIPPHs衍射峰的位移不明显，DBP分子结合量小，其位移变化不依赖于DBP质量浓度。因此，根据这一变化，实验可以通过对分子印迹膜的衍射峰变化判断样品中DBP分子的存在。如图7所示，将制备的MIPHs置于不同质量浓度的DBP样品中，在反应一段时间后，MIPPHs衍射峰发生红移，其位移与DBP的质量浓度呈正比例关系，由此可以拟合方程计算溶液中DBP的质量浓度。当DBP质量浓度为0.01～0.50 mg/L时，MIPHs的衍射峰发生明显位移，表明MIPPHs可以很好测定样品中DBP分子的存在和含量。在DBP质量浓度为0.01～0.10 mg/L范围内，MIPHs的位移量与DBP质量浓度呈良好的线性关系（＝0.992 0），MIPHs对DBP的检出限为0.01 mg/L（＝3），低于国家标准中DBP的检测标准（0.3 mg/kg）。实验结果表明，当样品溶液中存在DBP时，制备的MIPPHs在短时间即可与样品中DBP分子结合从而发生位移变化，达到快速定性检测样品中是否存在DBP的目的。

图6 MIPHs（A）和NIPHs（B）在不同质量浓度的DBP溶液中的光谱变化Fig.6 Spectral changes of MIPHs (A) and NIPHs (B) in DBP solutions at different concentrations

图7 MIPHs和NIPHs在不同质量浓度的DBP溶液中的衍射峰位移变化及线性回归曲线Fig.7 Change in diffraction peak displacement and linear regression curves of MIPHs and NIPHs in DBP solutions at different concentrations

2.5 选择性实验

实验选用MA和PA作为DBP结构类似物，考察制备的MIPHs对DBP选择性。由图8可知，在不同样品溶液中孵育反应一段时间后，MIPHs在DBP样品溶液中的衍射峰位移量明显高于MA和PA，表明MIPHs对DBP具有明显的选择性结合能力。作为对照，NIPHs在DBP和3 种结构类似物溶液中的衍射峰位移量变化不明显，进一步证明了分子印迹光子晶体聚合物膜对DBP的特异选择性。

图8 MIPHs和NIPHs在DBP、MA、PA溶液中的衍射峰位移变化Fig.8 Changes in diffraction peak displacement of MIPHs and NIPHs in DBP, MA and PA solutions

2.6 重复利用率

实验对制备的MIPPHs稳定性和重复利用率进行测定。如图9所示，制备的MIPPHs在经过5 次吸附-洗脱-吸附循环后，仍具有良好的光学性能，其最大特征峰与最初未结合DBP时接近，说明制备的高度交联的网状凝胶聚合物MIPPHs物理化学稳定性高，可以多次重复利用。

图9 MIPHs的重复利用率Fig.9 Recyclability of MIPHs

2.7 实际应用能力

考察制备的MIPHs对DBP检测的实际性能。由表1可知，将MIPHs分别置于添加不同含量的DBP白酒样品中，对添加DBP的白酒样品进行回收率测定，其加标回收率为95.60%～103.20%之间，表明MIPHs对DBP检测具有良好的可靠性，具备对酒类中DBP检测的实际应用潜力。

表1 MIPHs对白酒中DBP的检测Table 1 Results of detection of DBP in baijiu samples using MIPHs

3 结 论

开发设计基于反蛋白石结构的MIPHs传感器，实现样品中DBP的快速识别分析。实验制备MIPPHs的位移量变化与DBP质量浓度具有良好的线性关系，并成功用于白酒样品中DBP的检测，具有成本低、响应快、高选择性以及可靠性的优点。此外，本方法开发的MIPPHs传感器在对于食品安全领域有极大的应用潜力，可以推广到其他有害物质的快速检测，在现场实时检测，公众的健康保障以及食品卫生安全等领域具有积极的社会意义和实际价值。