陕西省典型冷冻食品中大肠杆菌的分子特征及耐药性检测

徐 旭，杨 静，张鹏飞，张钰嘉，阮傅倩，王 婷，李 雯，万阳丽，常冠红，张 瑶，王 新,*

（1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；2.杨凌质量技术检测检验所，陕西 杨凌 712100；3.西北农林科技大学创新实验学院，陕西 杨凌 712100；4.四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610066）

大肠杆菌是人和温血动物肠道中的共生菌群，属于条件致病菌，少数获得特殊毒力因子的大肠杆菌可引起人畜患病。致病性大肠杆菌携带毒力因子众多，如血清抗性蛋白iss、外膜蛋白、耐热肠毒素、黏附相关蛋白等。这些毒力因子是大肠杆菌引起人类食源性疾病的主要原因，能导致肠外感染（尿路感染、各种腹内、肺部、皮肤和软组织感染等）或肠道疾病（各种形式的腹泻，包括溶血性和尿毒症综合征）。根据它们的毒力因子和引起的临床症状，将其区分为肠外致病性大肠杆菌（extraintestinal pathogenic，ExPEC）和致泻性大肠杆菌（diarrheagenic，DEC），DEC根据感染症状进一步划分以下5 类：肠致病性大肠杆菌（enteropathogenic，EPEC）、肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhagic，EHEC）、肠产毒性大肠杆菌（enterotoxigenic，ETEC）、肠侵袭性大肠杆菌（enteric invasive，EIEC）和肠聚集性大肠杆菌（enteroaggregative，EAEC）。食用被致病大肠杆菌污染的食物可导致食源性疾病的发生。2008ü2015年、2017年，我国卫生健康委员会历年发布的《全国食物中毒事件情况的通报》中，由大肠杆菌引发的食物中毒事件占微生物食物中毒事件总数的5%～11%。

细菌耐药性已成为威胁全球动物和公共卫生的一个重大问题。大肠杆菌的耐药性逐年上升，在世界卫生组织所描述的12 种抗生素耐药“优先病原体”名单中，目前排名第3。世界各地已发现对-内酰胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑和四环素类具有高耐药水平的大肠杆菌的流行，对人类医学和兽医学都构成了潜在的高风险。此外，大肠杆菌获得抗生素耐药性的基因库增加，并且已被证明可以在不同细菌物种、宿主和环境中进行交换，耐药基因能够进行水平和垂直传播。已有报道表明耐药大肠杆菌可通过直接或间接接触（如食用受污染的食物和水）从环境传播给人类。

随着人们生活节奏的加快，冷冻食品因其方便快捷的优点受到广大消费者的青睐。冷冻保藏能够一定程度抑制微生物的生长繁殖，但冷冻食品并非绝对安全，许多病原微生物在冷冻条件下保持代谢活性和致病能力，如在低温条件下，大肠杆菌可长期处于亚致死状态，待条件恢复适宜后能够进行细胞修复并大量繁殖。我国已出现冰淇淋、速冻食品中大肠菌群超标的先例，比利时也报道了由冰淇淋中大肠杆菌引发的感染事件。目前，关于冷冻食品中大肠杆菌的流行及菌株分子特征及抗菌素耐药性情况的信息有限。因此，本实验对陕西地区冷冻食品（速冻水饺和冰淇淋）进行采样调查，分析大肠杆菌的污染、毒力基因、耐药性及种群分型情况，旨在为有效控制冷冻食品中大肠杆菌的污染提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

缓冲蛋白胨水、麦康凯琼脂、LB（Luria-Bertani）琼脂培养基、LB肉汤培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂（培养基、煌绿乳糖胆盐肉汤培养基 北京陆桥技术有限责任公司；所用15 种抗生素 北京索莱宝科技有限公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）所用2hMaster Mix、DNA Marker DL2000 南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

VD-850型桌上式洁净工作台 苏州净化设备有限公司；T100型梯度PCR仪、Gel Doc XR凝胶成像系统美国Bio-Rad公司；GNP-9080隔水式恒温培养箱、DHG-9132A电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；DYY-6C型电泳仪 北京六一生物技术有限公司；LDZX-50KBS立式高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；DH-11L无菌拍打均质机 宁波洛尚智能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品采集及处理

2011年8 月—2015年9月，于陕西省4 市（宝鸡、咸阳、西安和渭南）采集典型冷冻食品样本，共360 份，其中速冻水饺120 份和冰淇淋240 份。速冻水饺和冰淇淋均在－20 ℃冷藏销售。所有样本在低温条件下运送至本实验室，并在4 h内进行处理。具体采样信息见表1。

表1 冷冻食品采集地点、类型和数量Table 1 Sample collection locations, types and quantities

样本处理具体操作如下：按料液比1∶10（g/mL），将3 个速冻水饺（17 g/个）和完整冰淇淋（70 g/个）样本分别于450 mL和630 mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质机拍打制成样品匀浆。为防止在样本处理时造成交叉污染，每更换一次样本更换一双灭菌筷。

1.3.2 大肠菌群计数、大肠杆菌分离及鉴定

大肠菌群的计数参照GB 4789.3ü2010《食品微生物检验 大肠菌群计数》进行。每个样本挑取2 个大肠菌群鉴定为阳性的菌落至LB平板活化，并通过PCR扩增大肠杆菌管家基因作进一步鉴定，并将鉴定为阳性的菌株于－80 ℃冰箱中保存，备用。每个样本随机挑选1 株分离株进行耐药、毒力和种群分型实验。

1.3.3 DNA模板制备

采用煮沸法提取细菌基因组DNA模板。具体操作方法如下：将分离得到的大肠杆菌接种于LB琼脂培养基，37 ℃培养16～18 h。挑取2～3 个菌落至500 μL ddHO中，100 ℃加热20 min，12 000h离心3 min，吸取400 μL上清液于另一无菌EP管，即为DNA模板。所有模板保存于－20 ℃冰箱，备用。

1.3.4 毒力基因及耐药基因检测

采用PCR技术对大肠杆菌分离株21 种毒素基因和23 种耐药基因进行检测。其中21 种毒素基因包括12 种ExPEC相关毒力基因（、、、、、、、、、、、）、1 种EPEC毒力基因（）、1 种EIEC毒力基因（）、1 种EAEC毒力基因（）、2 种EHEC毒力基因（、）、4 种ETEC毒力基因（、、、）；23 种耐药基因包括：四环素耐药基因（、、）、磺胺类耐药基因（、、）、-内酰胺类耐药基因（、、）、喹诺酮类耐药基因（、、、、）、多黏菌素耐药基因（、）、氯霉素类耐药基因（）以及氨基糖苷类耐药基因（、、、、、、’VI）。

1.3.5 药敏实验

参照美国临床和实验室标准协会推荐的琼脂稀释法，对49 株大肠杆菌分离株进行15 种抗生素的药敏实验。多黏菌素B的耐药判断根据欧盟药敏试验标准委员会标准进行。15 种抗生素及其耐药折点见表2。

表2 药敏测定用抗生素及耐药折点Table 2 Resistance breakpoints for antibiotics

表3 四重基因型划分大肠杆菌系统发育群Table 3 Quadruplex genotypes for assigning E.coli isolates to phylo-groups

1.4 数据统计及分析

所有数据使用Microsoft Excel 2016软件进行统计整理，其中大肠菌群计数结果为同一稀释度下两次平行计数的均值，菌株耐药表型检测为3 个平行中至少2 个平行一致的结果。绘图工具使用Origin 2021软件（OriginLab公司）。使用SPSS 18.0软件检验进行不同样品类别、地区、包装方式及月份之间的大肠杆菌检出结果的差异显著性分析，＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌检出、计数结果

如表4所示，360 份冷冻食品中49 份检测为大肠杆菌阳性（13.6%，49/360），包括速冻水饺样本42 份（35.0%，42/120）和冰淇淋样本7 份（2.9%，7/240）。42 份速冻水饺阳性样本中，大肠菌群数小于10 CFU/g有25 份（20.8%），大肠菌群数为10～100 CFU/g有12 份（10.0%）和大肠菌群数大于100 CFU/g有5 份（4.2%）。7 份冰淇淋阳性样本中，大肠菌群数小于10 CFU/g有5 份（2.1%）和大肠菌群数为10～100 CFU/g有2 份（0.8%）。此外，速冻水饺大肠杆菌阳性样本数显著高于冰淇淋样本（＜0.05）。

表4 冷冻食品中分离的大肠杆菌流行情况及大肠菌群计数Table 4 Prevalence of E.coli and coliform counts in frozen foods

如表5所示，4 市速冻水饺样品大肠杆菌污染较为严重，受污染最高的地区为西安市（43.3%，13/30），其次为咸阳市（40.0%，12/30）、宝鸡市（33.3%，10/30）和渭南市（23.3%，7/30）。按照不同馅料进行分类，速冻水饺中大肠杆菌污染率最高的为肉馅水饺（包括羊肉和猪肉）（36.2%，34/94）、其次是海鲜馅（33.3%，4/12）和蔬菜馅水饺（28.6%，4/14）。此外，对不同采样地点及不同馅料速冻水饺阳性样本数进行统计分析，速冻水饺大肠杆菌阳性样本数不存在显著差异（＞0.05）。

表5 速冻水饺中大肠杆菌流行情况Table 5 Prevalence of E.coli isolated from quick-frozen dumplings

如表6所示，冰淇淋样本中大肠杆菌检出率较低，其中咸阳市和西安市检出最高，均为3.8%（3/79），其次为宝鸡市（1.2%，1/82）。对不同采样地区便利店和超市进行分类，便利店大肠杆菌的检出率（5.2%，6/116）高于超市（0.8%，1/124）。对不同包装方式进行分类，袋装冰淇淋样本的大肠杆菌检出率（3.2%，5/156）高于盒装样本（2.4%，2/84）。对采集月份进行分类，7月份样品（6.7%，4/60）中大肠杆菌检出率高于6月份样品（5.1%，3/59），8月和9月采集样本中没有分离到大肠杆菌。对不同采样地点、超市规模、包装方式和采集月份冰淇淋大肠杆菌检出阳性样本数进行统计分析，超市规模对冰淇淋中大肠杆菌污染影响显著（＜0.05），其余分类中冰淇淋大肠杆菌阳性样本数不存在显著差异（＞0.05）。

表6 不同包装方式和月份的便利店和超市冰淇淋中大肠杆菌的流行率Table 6 Prevalence of E.coli in ice cream sold at retail stores and supermarkets, in ice cream packaged with different packaging methods and in ice cream collected in different months

2.2 毒力基因检出结果

如表7所示，对49 株大肠杆菌进行21 种毒力基因检测，共9 种毒力基因被检出，包括7 种ExPEC相关毒力基因（、、、、、和）、2 种DEC毒力基因（和）。其中基因和的检出率最高为14.3%，其次是（12.2%）、（10.2%）、（8.2%）、（4.1%）、（4.1%），和的检出率均为2.0%。根据和这两种特异性基因，DEC菌株被分为以下两类：EPEC（=4）和EIEC（=2）。

表7 大肠杆菌分离株毒力基因检出结果Table 7 Results of detection of virulence genes of E.coli

续表7

2.3 耐药实验结果

如表8所示，49 株大肠杆菌分离株对阿莫西林/克拉维酸钾和甲氧苄啶/磺胺甲恶唑（98.0%，48/49）耐药最为普遍，其次为四环素（20.4%，10/49）、氨苄西林（16.3%，8/49）和氯霉素（8.2%，4/49），对庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星、头孢曲松、头孢噻污、头孢哌酮、头孢他啶的耐药率较低（2.0%，1/49）。此外，受试菌株对头孢西丁和多黏菌素敏感。

表8 不同冷冻食品中大肠杆菌分离株耐药情况Table 8 Resistance rates of E.coli isolates from different frozen foods

如图1所示，49 株分离株共表现为8 种耐药谱。所有分离株至少耐受1 种所测抗生素，最常见的耐药谱为A/C-T/S（71.4%，35/49），其次为TET-A/C-T/S（10.2%，5/49）。20.4%（10/49）的菌株为多重耐药菌株，均至少耐受3 种所测抗生素。此外，1 株分离自蔬菜水饺的菌株对13 种抗生素表现出耐药。

图1 冷冻食品中大肠杆菌耐药表型谱Fig.1 Antimicrobial resistance profile of E.coli isolates from frozen foods

对7 类抗生素耐药相关基因检测结果如表9所示。-内酰胺类抗性基因检出（14.3%）、（8.2%）和（2.0%）；氨基糖苷类抗性基因检出（8.2%）、（6.1%）、（2.0%）和（2.0%）；四环素类抗性基因检出（12.2%）和（4.1%），未检出；磺胺类抗性基因检出（10.2%）、（8.2%）和（2.0%）；喹诺酮类抗性基因检出（6.1%）、（2.0%）、（2.0%）和（2.0%）和多黏菌素类抗性基因检出（2.0%）。此外，氯霉素类耐药基因未检出。

表9 大肠杆菌分离株耐药基因检测结果Table 9 Results of detection of resistance genes of E.coli

2.4 大肠杆菌耐药表型与耐药基因相关性

如图2所示，统计49 株大肠杆菌分离菌株的耐药表型和基因型发现，除四环素类抗生素的耐药基因型和表型基本吻合外，其余5 类抗生素的耐药表型和基因型不完全一致。本实验未检出氯霉素相关耐药基因，但有4 株分离株对氯霉素表现为耐药；携带-内酰胺类耐药基因的菌株有9 株，但98.0%（48/49）的受试菌株对-内酰胺类抗生素表现为耐药。

图2 大肠杆菌耐药表型和基因型相关性Fig.2 Correlation between antibiotic resistant phenotypes and genotypes of E.coli isolates

2.5 大肠杆菌种群分型检测结果

如图3所示，根据不同进化群携带的标志基因将大肠杆菌分为8 个进化群，本实验中大肠杆菌分离株系统发育群分别为A群、B1群、C群和F群。其中以A群占比最多，为63.3%（31/49），其后依次为C群（18.4%，9/49）、B1群（16.3%，8/49）和F群（2.0%，1/49）。EPEC和EIEC菌株均属于A群。冰淇淋样品分离株全部属于A群系，速冻水饺样品分离株以A群（24/42）为优势群，其次为C群（9/42）、B1群（8/42）、F群（1/42）。

图3 大肠杆菌系统发育群Fig.3 Phylogenetic group distribution of E.coli

3 讨论与结论

近年来，由大肠杆菌引发的食物安全事件层出不穷。据美国疾病控制和预防中心的数据统计显示，2000ü 2008年间大肠杆菌导致了203 000 例食源性疾病。大肠杆菌作为食品粪便污染指标，其存在通常与不卫生、不适当的食品处理方式、交叉污染或不当的食品贮藏条件有关，是引起食源性疾病的重要原因之一。

本研究对我国陕西省4 市（宝鸡、咸阳、西安和渭南）冷冻食品进行大肠杆菌监测，发现大肠杆菌检出率为13.6%（49/360）。这一结果低于罗娟、史辉、只帅等分别对新疆、成都和陕西即食食品和零售肉类中大肠杆菌检出率，表明低温能一定程度限制食品中微生物的生长繁殖。方梦渔等对市场上销售的冷冻食品进行抽样检测，发现21.56%的样品中存在大肠菌群超标现象。King等曾报道因食用受大肠杆菌污染的冷冻牛肉产品，导致18 名儿童出现小儿溶血尿毒综合征。因此，不能忽视冷冻食品中大肠杆菌的污染。速冻水饺中大肠杆菌检出率显著高于冰淇淋样本，其中以肉馅（包括羊肉和猪肉）水饺的大肠杆菌检出率最高（36.2%，34/94）。导致该结果的原因可能是由于肉馅填料的营养结构更适宜微生物的生长繁殖。所有样品中有5 份速冻水饺样品大肠菌群数量超过100 CFU/g。目前我国尚未对速冻水饺（生制品）中大肠菌群作出限量规定，但根据GB 19295ü2011《速冻面米制品》对速冻熟制品的要求，大肠菌群数的最高安全限量应小于100 CFU/g。速冻水饺若加热不彻底或存在不能被加热有效灭活的毒素（如STa），所导致的安全隐患不容忽视。STa是由ETEC产生的耐热型肠毒素，摄入被其污染的食物将导致急性腹泻。

对于冰淇淋样本，便利店（5.2%，6/116）样本大肠杆菌检出率高于超市（0.8%，1/124），袋装样本（3.2%，5/156）冰淇淋的大肠杆菌检出率高于盒装样本（2.4%，2/84）。这可能是由于便利店在销售过程中的冷链保存环节不完善以及袋装样品更容易受到温度波动的影响，导致冷冻食品的冻融引起微生物的生长繁殖。冰淇淋样本中大肠菌群数未超过GB 2759ü2015《冷冻饮品和制作料》的限量标准，但冰淇淋作为即食食品，一些致病性强的大肠杆菌的低水平污染也可能构成重大风险。2007年比利时曾暴发一起由某农场生产销售的冰淇淋引发的大肠杆菌感染事件，涉及12 人感染。综上，冷冻食品中大肠杆菌的污染对消费者的健康具有潜在威胁。

大肠杆菌的致病能力与其携带的毒力因子密切相关。本研究发现分离株的ExPEC相关基因检出率较高，包括铁转运相关基因（、、、）、黏附基因（、）和抗血清存活因子相关基因。已有研究证明铁转运基因能够显著增强大肠杆菌在宿主体内的存活能力，Aslam等从冷冻肉中分离的大肠杆菌中和基因检出率较高，与本研究结果一致，推测摄铁能力可能增强大肠杆菌对低温条件的抵抗能力。此外，在本研究中与常同时存在于1 株菌中，是耶尔森菌强毒力岛标志基因，能够在几乎所有携带的大肠杆菌中表达，增强大肠杆菌的致病性。国外相关研究已将铁载体合成基因（、）作为鉴定ExPEC菌株的参考指标之一。本次调查也证实了本地区冷冻食品存在ExPEC污染的风险。此外，根据和这2 种特异性基因，DEC分离株被区分为EPEC（8.2%，4/49）和EIEC（4.1%，2/49）。付宇和Lima等报道食源致病性大肠杆菌主要以EPEC和EIEC为主。EPEC是发展中国家婴儿腹泻的主要原因；EIEC与志贺氏菌属密切相关，可引起人类细菌性痢疾。由于冰淇淋在食用前无需加热，其中致病性大肠杆菌的检出意味着对消费者的健康构成潜在威胁。结果还显示，来自肉馅速冻水饺的大肠杆菌的毒力基因携带率较高（30.6%，15/49）。这一结果与Badri和Badi等对动物源食品中携带毒力基因的大肠杆菌检出率相似。这表明动物源食品可能是引起相关食源性疾病的主要载体，受污染的生肉或未煮熟的肉类在食源性病原体的传播过程中尤为重要。

本研究中大肠杆菌分离株对阿莫西林/克拉维酸、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、四环素和氨苄西林的耐药率较高。欧洲食品安全局报告称，-内酰胺类抗生素、四环素和甲氧苄啶/磺胺甲恶唑是食品中大肠杆菌多重耐药模式中最常见的抗生素，这些抗生素的高耐药率可能与其在畜牧业和人类中的普遍使用有关，导致耐药率较高。本研究中DEC菌株至少耐受1 种所测抗生素。耐药致病性大肠杆菌对食品的污染，尤其是即食食品，会对消费者的健康构成威胁。这些菌株可能在肠道内将抗性基因转移给其他病原微生物或共生细菌，从而导致选择或使用合适的治疗方法变得困难。一株分离自蔬菜水饺的菌株对13 种抗生素表现出耐药，其属于B1群系。速冻水饺生产工艺复杂，大肠杆菌的污染可能发生在食品生产链的多个环节，包括原料、加工、销售等。动物源大肠杆菌优势群系为B1群系，人源大肠杆菌优势群系为B2群。Araújo等也曾报道有机肥的使用导致来自蔬菜的菌株具有较高的多重耐药水平。因此推测是原料受到来自动物源多重耐药大肠杆菌污染。研究结果还显示耐药菌株的表型和基因型并不完全一致。大肠杆菌对阿莫西林/克拉维酸的耐药性通常由介导，与Karmele等报道不同的是，本研究中仅有1 株对阿莫西林/克拉维酸耐药的菌株携带基因。这表明可能存在其他因素介导菌株产生耐药性。目前，普遍认为主动外排作用是细菌产生耐药性的主要机制，Kumar等报道大肠杆菌中的抗性结节细胞分离超家族能够促使大肠杆菌主动外排氯霉素、-内酰胺类、四环素等抗生素。因此，分离菌株耐药但不携带耐药基因可能是由于大肠杆菌能够通过主动外排泵将药物从菌体内排出；而敏感菌株携带耐药基因则可能是耐药基因或相关酶活性被抑制。此外，从速冻水饺样品中分离得到1 株携带的菌株，但对多黏菌素并未表现出耐药性。多黏菌素目前用于治疗人类和家畜由多重耐药病原体引起的感染，是一种重要的抗生素。能够降低大肠杆菌对多黏菌素的敏感性，被多黏菌素诱导表达产生耐药性，需要严格监测其潜在传播。基因通常位于质粒，能够在细菌间进行快速转移。需考虑到食源性大肠杆菌耐药基因可能通过食物链传递给人类严重威胁人体健康。

本研究确定了从冷冻食品中分离的49 株大肠杆菌分离菌株系统发育群，优势群系为A群系，其次为C群。Koo等报道了食源性大肠杆菌大多属于A和B1群，与本研究中分离菌株多属于A和C群系的结果存在差异，出现这种差异的原因是A和C群具有高度相关性，在三重基因型划分系统发育群中常一同被归类为A群。已有报道称大肠杆菌的系统发育群与毒力及致病性之间存在相关性。Duriez等研究表明肠道致病型及共生型大肠杆菌优势群系为A、B1或D，其携带毒力基因较少，致病能力较弱；ExPEC多属于B2和D组。这与本实验中DEC菌株优势群系为A群的结果相符。但本实验结果中多重耐药性及携带毒力基因的菌株多属于A和B1群，且基因是B1群菌株中观察到的最常见基因，其能够增强菌株引起感染的能力。因此需要重视A和B1群系对公共健康的影响。同时本实验还分离出1 株F群系多重耐药菌株，该群系与B2群具有高度相关性和几乎相当的致病潜力。该菌株携带4 个ExPEC相关基因，增强了其在肠道外引起感染的能力，目前已有研究报道F群系菌株可能引起尿路感染。

通过对陕西省冷冻食品大肠杆菌的监测，结果表明预包装冷冻食品不可避免存在大肠杆菌的污染风险。本研究调查发现冷冻食品中分离得到EPEC和EIEC的菌株，且存在ExPEC菌株污染的风险。因此，为防止大肠杆菌对冷冻食品的污染，食品加工、运输和贮藏环境需要加以改善。此外，对动物养殖过程中抗生素的使用加以干预，对于防止细菌抗生素耐药性的传播十分必要。由于食品生产链中存在来自环境和人类的交叉污染，需要进一步的流行病学研究，以确定不同食品生产环节的潜在污染源。