新型四唑[1,5-a]并嘧啶-5,7-二醇衍生物的合成及对Cdc25B抑制活性评价

杨 娜, 鲁 源, 张晓晖*

(1.内蒙古医科大学附属医院 药剂部,内蒙古 呼和浩特 010050； 2.内蒙古医科大学 药学院,内蒙古 呼和浩特 010059)

随着人口老龄化、居民生活压力增加以及环境污染等因素,恶性肿瘤的发病率和死亡率逐年上升,已成为当前社会最具破坏性的疾病之一,严重威胁着人类的健康和生命[1-2]。细胞分裂周期25B磷酸酶(Cdc25B)是细胞分裂周期的关键调控因子,具有促进细胞有丝分裂的作用[3]。研究证明,Cdc25B在食管癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌和肺癌等多种人类癌症中过度表达,Cdc25B已成为一个治疗癌症的重要靶点[4-6]。

研究发现,大量杂环化合物通过抑制Cdc25B的活性而起到抗肿瘤的作用[7-10]。嘧啶衍生物是一类重要的杂环化合物,具有重要的化学和药理学意义,其本身具有杀菌、除草、抗病毒、抗癌、抗炎、抗氧化等多种生物活性,其中,抗癌活性在医药领域得到了广泛关注和研究[11-13]。近年来,本课题组一直致力于杂环类抗肿瘤药物的研究与合成,期望可以筛选出较好的Cdc25B抑制剂[14-20]。

本文以5-氨基四唑和丙二酸二乙酯为原料,合成了四唑[1, 5-a]并嘧啶-5,7-二醇(1)和一系列新型四唑[1, 5-a]并嘧啶-5,7-二醇衍生物(2a～2m),这些化合物均未见文献报道。其结构经1H NMR,13C NMR, IR, ESI-MS和元素分析等表征。合成路线如图所示(Scheme 1)。

Scheme 1

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

XT-4A型双目显微熔点测定仪(温度未经校正)；UV-100型分光光度计；Bruker AV-500 MHz型核磁共振波谱仪(TMS为内标,DMSO为溶剂)；Nicolet Impact 410型红外光谱仪(KBr压片)；Finnigan Lcq Advantage Max型液-质联用仪；PE-2400型元素分析仪。

所用试剂均为分析纯。

1.2 合成

(1) 四唑[1, 5-a]并嘧啶-5,7-二醇(1)的合成

将1 g的5-氨基四唑与5.6 mL的丙二酸二乙酯置于反应瓶中,于150 ℃下加热搅拌2 h。用50%乙醇溶液稀释反应混合物,析出大量固体产物,过滤,乙醚洗涤(3×10 mL)。用DMF/乙醇重结晶,得黄色晶体1.21 g,产率81%, m.p.298～300 ℃;1H NMRδ: 12.14(1H, OH/NH), 11.21(1H, OH), 3.95(s, 1H, C=C—H); IRν: 3312(—OH), 3127(—NH—), 1691(C=O) cm-1; ESI-MSm/z: 153{[M+H]+}; Anal. Calcd for C4H3N5O2: C 31.38, H 1.98, N 45.74, found C 31.40, H 1.95, N 45.71。

(2) 6-苯基偶氮四唑[1, 5-a]并嘧啶-5,7-二醇(2a～2m)的合成

将取代苯胺1.5 mmol和水2 mL加入反应瓶,冰水浴下滴加浓盐酸4 mL,析出白色固体。将亚硝酸钠0.10 g(1.5 mmol)溶于8 mL水中,缓慢滴加到上述体系中,0～5℃搅拌1 h,得到取代苯胺的重氮盐溶液,备用。

将0.23 g(1.5 mmol)化合物1溶解于AlCl3溶液(0.5 gAlCl3溶于60 mL水)中,在0～5 ℃下滴加取代苯胺的重氮盐溶液,滴毕,于室温搅拌过夜。所得固体经抽滤,冷水洗涤,干燥,DMF/水重结晶得到目标产物2a～2m。

2a: 橘色晶体0.32 g,产率85%, m.p.>320 ℃;1H NMRδ: 12.15(1H, hydrazoNH), 11.19(1H, OH), 8.27～7.52(m, 4H, ArH);13C NMRδ: 162.23, 155.98, 152.08, 149.66, 142.04, 130.08, 128.15, 124.56, 123.71, 119.92; IRν: 3365(—OH), 3144(—NH—), 3087(ArH), 1682(C=O) cm-1; Anal.Calcd for C10H6ClN7O2: C 41.18, H 2.07, Cl 12.16, N 33.62, found C 41.16, H 2.09, Cl 12.19, N 38.63。

2b: 橘色晶体0.36 g,产率81%, m.p.320 ℃;1H NMRδ: 12.03(1H, hydrazoNH), 11.32(1H, OH), 8.12～7.37(m, 4H, ArH);13C NMRδ: 162.26, 155.99, 152.08, 150.17, 141.87, 133.98, 130.21, 122.95, 119.33, 117.59; IRν: 3412(—OH), 3155(—NH—), 3042(ArH), 1667(C=O) cm-1; Anal.Calcd for C10H6ClN7O2: C 41.18, H 2.07, Cl 12.16, N 33.62, found C 41.20, H 2.06, Cl 12.13, N 33.60。

2c: 棕色晶体0.40 g,产率88%, m.p.>330 ℃;1H NMRδ: 12.19(1H, hydrazoNH), 11.21(1H, OH), 8.33～7.69(m, 4H, ArH);13C NMRδ: 162.22, 155.95, 152.08, 147.75, 142.01, 130.02, 128.16, 119.94; IRν: 3317(—OH), 3169(—NH—), 3077(ArH), 1680(C=O) cm-1; Anal.Calcd for C10H6ClN7O2: C 41.18, H 2.07, Cl 12.16, N 33.62, found C 41.21, H 2.04, Cl 12.17, N 38.65。

2d: 橘色晶体0.43 g,产率90%, m.p.>320 ℃;1H NMRδ: 12.14(1H, hydrazoNH), 11.34(1H, OH), 8.23～7.69(m, 4H, ArH), 3.68(s, 3H,o-OCH3);13C NMRδ: 162.74, 156.03, 152.07, 145.87, 141.99, 136.65, 123.77, 123.53, 119.96, 117.08, 51.49; IRν: 3322(—OH), 3187(—NH—), 3078(ArH), 2889(AliphH), 1681(C=O), 1110(C—O) cm-1; Anal.Calcd for C11H9N7O3: C 46.00, H 3.16, N 34.13, found C 46.02, H 3.13, N 34.15。

2e: 棕色晶体0.41 g,产率91%, m.p.>330 ℃;1H NMRδ: 12.32(1H, hydrazoNH), 11.14(1H, OH), 8.25～7.61(m, 4H, ArH), 3.78(s, 3H,m-OCH3);13C NMRδ: 162.53, 160.08, 156.01, 152.07, 150.15, 141.67, 130.78, 113.66, 112.17, 108.47, 51.96; IRν: 3237(—OH), 3160(—NH—), 3076(ArH), 2864(AliphH), 1693(C=O), 1120(C—O) cm-1; Anal.Calcd for C11H9N7O3: C 46.00, H 3.16, N 34.13, found C 45.99, H 3.18, N 34.16。

2f: 黑色晶体0.34 g,产率88%, m.p.315 ℃;1H NMRδ: 12.23(1H, hydrazoNH), 11.17(1H, OH), 8.17～7.28(m, 4H, ArH), 3.57(s, 3H,p-OCH3);13C NMRδ: 162.89, 155.99, 153.07, 152.07, 144.71, 141.85, 120.03, 119.18, 51.63; IRν: 3268(—OH), 3155(—NH—), 3079(ArH), 2863(AliphH), 1685(C=O), 1121(C—O) cm-1; Anal.calcd for C11H9N7O3: C 46.00, H 3.16, N 34.13, found C 46.02, H 3.15, N 34.11。

2g: 黑色晶体0.43 g,产率90%, m.p.>330 ℃;1H NMRδ: 12.28(1H, hydrazoNH), 11.14(1H, OH), 8.23～7.34(m, 4H, ArH);13C NMRδ: 162.52, 156.01, 152.08, 145.21, 141.96, 138.76, 135.45, 124.38, 123.59, 119.93; IRν: 3298(—OH), 3151(—NH—), 3114(ArH), 1693(C=O) cm-1; Anal.Calcd for C10H6N8O4: C 39.74, H 2.00, N 37.08, found C 39.76, H 2.02, N 37.05。

2h: 黑色晶体0.43 g,产率83%, m.p.>320 ℃;1H NMRδ: 12.18(1H, hydrazoNH), 11.14(1H, OH), 8.15～7.41(m, 4H, ArH);13C NMRδ: 162.55, 156.03, 152.08, 150.13, 149.37, 142.02, 130.78, 124.86, 117.99, 114.76; IRν: 3310(—OH), 3125(—NH—), 3098(ArH), 1695(C=O) cm-1; Anal.Calcd for C10H6N8O4: C 39.74, H 2.00, N 37.08, found C 39.77, H 1.98, N 37.07。

2i: 棕色晶体0.49 g,产率93%, m.p.>330 ℃;1H NMRδ: 12.29(1H, hydrazoNH), 11.16(1H, OH), 8.21～7.64(m, 4H, ArH);13C NMRδ: 162.62, 156.03, 153.35, 152.08, 142.31, 142.03, 125.28, 119.94; IRν: 3299(—OH), 3129(—NH—), 3081(ArH), 1689(C=O) cm-1; Anal.Calcd for C10H6N8O4: C 39.74, H 2.00, N 37.08, found C 39.71, H 2.03, N 37.06。

2j: 棕色晶体0.33 g,产率69%, m.p.>320 ℃;1H NMRδ: 12.15(1H, hydrazoNH), 11.15(1H, OH), 8.15～7.51(m, 4H, ArH), 2.52(s,3H,o-CH3);13C NMRδ: 162.33, 155.99, 152.08, 149.55, 142.04, 130.18, 128.56, 127.74, 122.93, 119.07, 22.58; IRν: 3389(—OH), 3167(—NH—), 3077(ArH), 2918(AliphH), 1689(C=O) cm-1; Anal.Calcd for C11H9N7O2: C 48.71, H 3.34, N 36.15, found C 48.73, H 3.31, N 36.12。

2k: 黑色晶体0.34 g,产率68%, m.p.>320 ℃;1H NMRδ: 12.25(1H, hydrazoNH), 11.13(1H, OH), 8.21～7.32(m, 4H, ArH), 2.29(s, 3H,m-CH3);13C NMRδ: 162.27, 155.97, 152.08, 149.31, 142.01, 137.18, 129.98, 123.37, 119.48, 117.09, 22.87; IRν: 3278(—OH), 3139(—NH—), 3087(ArH), 2875(AliphH), 1682(C=O) cm-1; Anal.Calcd for C11H9N7O2: C 48.71, H 3.34, N 36.15, found C 48.68, H 3.36, N 36.17。

2l: 橘色晶体0.33 g,产率69%, m.p.>320 ℃;1H NMRδ: 12.17(1H, hydrazoNH), 11.12(1H, OH), 8.15～7.31(m, 4H, ArH), 2.41(s, 3H,p-CH3);13C NMRδ: 162.21, 155.92, 152.07, 148.12, 141.88, 131.22, 130.25, 119.23, 22.74; IRν: 3305(—OH), 3145(—NH—), 3097(ArH), 2962(AliphH), 1696(C=O) cm-1; Anal.Calcd for C11H9N7O2: C 48.71, H 3.34, N 36.15, found C 48.72, H 3.35, N 36.16。

2m: 棕色晶体0.38 g,产率84%, m.p.>310 ℃;1H NMRδ: 12.22(1H, hydrazoNH), 11.35(1H, OH), 8.17～7.22(m, 5H, ArH);13C NMRδ: 162.44, 155.43, 152.08, 149.35, 141.57, 129.88, 122.87, 119.16; IRν: 3345(—OH), 3148(—NH—), 3066(ArH), 1686(C=O) cm-1; Anal.Calcd for C10H7N7O2: C 46.70, H 2.74, N 38.12, found C 46.73, H 2.77, N 38.10。

2 结果与讨论

2.1 反应条件的选择

据文献报道,用5-氨基吡唑,5-氨基-s-三唑与丙二酸二乙酯在乙醇钠溶液中反应可得到吡唑[1,5-a]并嘧啶-5,7-二醇和s-三唑[2,3-a]并嘧啶-5,7-二醇[18-19]。但在本实验中,用5-氨基四唑和丙二酸二乙酯在相同条件下未成功合成四唑[1,5-a]并嘧啶-5,7-二醇,而5-氨基四唑与过量的丙二酸二乙酯在150 ℃加热2 h,得到了四唑[1,5-a]并嘧啶-5,7-二醇(1)。

在衍生物2a～2m的合成中,我们首先以衍生物2d的制备为模型反应,利用TLC对反应条件进行优化。在以AlCl3为催化剂,pH值为5.0的酸性条件下,在0～5 ℃的冰水浴中,取代苯胺的重氮盐溶液与化合物1发生了非均相偶联,呈现出有色的2d。在不含AlCl3的水溶液中,不能形成偶氮嘧啶或偶氮嘧啶不显色,说明AlCl3作为催化剂,由于其发生水解可提高反应介质的酸度。

2.2 谱学数据分析

化合物1的IR显示,在3127 cm-1处(N—H)、 3312 cm-1处(O—H)、 1691cm-1处(C=O)均有较强的吸收峰。化合物1的1H NMR显示,δ12.14(1H, OH或NH)处有一个单峰,δ11.21(1H, OH)处有一个单峰,δ3.95(s, 1H, C=C—H)处有一个单峰。

目标化合物2a～2m可能以两种互变异构体形式存在,即以偶氮烯醇(A)和偶氮酮(B)的形式存在(Chart 1)。所有目标化合物的IR在3183～3125 cm-1处(N—H)、 3213-3425 cm-1处(O—H)、 1692～1662 cm-1处(C=O)有强吸收峰。各目标化合物氢的数量和化学位移也都可以在1H NMR中找到其相应的数据。2j,2k,2l分别在δ2.52, 2.29, 2.41(o-CH3,m-CH3,p-CH3)处有一个单峰。2d,2e,2f分别在δ3.68, 3.78, 3.57(o-OCH3,m-OCH3,p-OCH3)处有一个单峰。

Chart 1

化合物2a～2m在δ8.33～7.09(Ar—H)处有多重峰；在δ11.45～10.70(1H, OH),δ12.32～12.03(1H, hydrazoNH)处有单峰。通过光谱数据分析得知,目标化合物因其在固态和DMSO中以分子内氢键保持稳定而以结构B的形式存在。

2.3 目标化合物对Cdc25B的抑制活性

采用荧光底物OMFP,经Cdc25B去磷酸化后得到的产物OMF在被485 nm激发光激发后可发射出波长为535 nm的可检测的荧光信号,从而观察酶的活性变化以及化合物对其的抑制情况。实验中Cdc25B所采用的阳性参照化合物为Na3VO4,经初步筛选,选择的纯化合物浓度为20 μg·mL-1,而对于抑制率大于50%的样品,继续测试其活性剂量的依赖关系。通过样品活性对样品浓度进行非线性拟和,通过软件Graphpad Prism 4计算得到IC50值(酶活性被抑制50%时药物的浓度)。此部分工作由国家新药筛选中心协助完成,结果如表1所示。

表1 目标化合物2a～2m对Cdc25B的抑制活性

由表1实验结果可知,化合物2b,2c,2h,2i和2m对Cdc25B有良好的抑制活性,抑制率分别为84.57%, 79.36%, 95.35%, 96.97%和97.66%, IC50值为(0.94±0.04)～(2.18±0.11) μg·mL-1。目标化合物的活性均低于阳性对照物Na3VO4。通过对目标化合物活性结果分析发现,在苯环无取代基或在苯环间位和对位引入吸电子基时活性增强。

本文合成了新的嘧啶衍生物四唑[1,5-a]并嘧啶-5,7-二醇(1),并在含AlCl3的水中制备了一系列新的苯基偶氮四唑并嘧啶(2a～2m)。研究了苯基偶氮四唑并嘧啶(2a～2m)的结构表征及生物活性。这些衍生物的吸收光谱结果表明,结构B是其存在形式。此外,通过国家新药筛选中心进行的药理活性筛选结果发现,化合物2b,2c,2h,2i和2m对Cdc25B有较高的抑制率,其中化合物2m对Cdc25B的抑制活性最高,IC50值为(0.94±0.04) μg·mL-1,为新型Cdc25B抑制剂的筛选提供了参考。