响应面优化沙棘果渣膳食纤维提取工艺及应用性质评价

郭京京，李雅轩，樊子怡，陈炫彤，王 琪，符 群,2*

1东北林业大学林学院；2黑龙江省森林食品资源利用重点实验室，哈尔滨 150040

沙棘HippophaerhamnoidesLinn.又称酸刺、酸柳，其果实在民间有悠久的药食兼用历史，沙棘叶片也在近年纳入新资源食品名录。我国是世界上天然沙棘种质资源最丰富的国家，不仅野生沙棘资源丰富，也是人工种植沙棘面积最大的国家，是“三北”防护林的重要树种之一，据统计，截至2022年1月，我国沙棘总种植面积约3 107万亩，占世界沙棘种植量的90%以上。沙棘果因富含维生素[1]、黄酮、多酚、有机酸、亚油素、必需氨基酸等生物活性物质，被认为是预防和治疗心血管疾病、糖尿病、炎症性疾病、皮肤病、胃溃疡甚至癌症的良好植物资源[2,3]。

目前我国沙棘产业主要以饮料加工和提炼沙棘油为主。其中，Zeng等[4]得出微波预处理+短时加速溶剂萃取将能提高沙棘油的营养品质；Liu等[5]优化了沙棘果油提取工艺；Fu等[6]以沙棘原浆为原料研制沙棘发酵饮料；Li[7]对沙棘果酒加工现状进行分析，以促进沙棘果酒的发展。沙棘加工果实出渣率约20%，多数被干燥为动物饲料或被废弃，直接导致环境污染及土地资源浪费。沙棘果渣中膳食纤维含量高达50%以上。膳食纤维被营养学界誉为“第七大营养素”，可作为重要的食品填充剂[8]；可促进有益肠道细菌的繁殖，增加人体内的吸收能力，减少血浆中的胆固醇和甘油三酯，有助于控制肥胖等健康功效。

基于此，本研究对沙棘果酒行业废弃物沙棘果渣中的可溶性膳食纤维(soluble dietary fiber，SDF)和不可溶性膳食纤维(insoluble dietary fiber，IDF)进行提取工艺优化，对比研究不同膳食纤维的应用性质，以期为沙棘产业中废弃资源的充分利用，产出不同用途分型的高附加值膳食纤维产品，延长沙棘产业链奠定理论参考。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

沙棘果渣(黑龙江省农科院园艺分院)；α-淀粉酶(CAS9001-19-8，4 000 U/g)、胰蛋白酶(CAS9002-07-7，250 U/mg)、纤维素酶(CAS9012-54-8，50 U/mg)(上海源叶生物科技有限公司)；石油醚、95%乙醇等为国产分析纯。

仪器设备：AL-1041C分析天平(METTLER TOLEDO公司)；EPOCH12酶标分析仪(BioTek Instruments，Inc，美国)；SB25-12DTD超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)等。

1.2 实验方法

1.2.1 原料处理

沙棘果渣经50 ℃恒温干燥，粉碎过60目筛，经过石油醚脱脂后，脱溶干燥并冷藏保存。

1.2.2 超声波辅助酶解法提取沙棘果渣膳食纤维的方法

准确称取1.000 g脱脂后的沙棘果渣粉加入20 mL蒸馏水，2 mol/L NaOH调至pH为8.1后加入6%胰蛋白酶(按沙棘果渣粉的质量计，下同)37 ℃水浴30 min，冷却至室温，2 mol/L冰醋酸调至pH6.0后加入8%α-淀粉酶95 ℃水浴45 min，沸水浴10 min灭酶，冷却；加入纤维素酶在不同超声条件下提取，灭酶冷却，5 500 r/min离心10 min，70 ℃蒸馏水洗涤沉淀至中性，离心干燥，得不溶性膳食纤维(insoluble dietary fiber，IDF)；将上清液(第一次离心)与洗涤液合并，浓缩为原体积的1/3，醇沉1 h，离心，干燥，得到可溶性膳食纤维(soluble dietary fiber，SDF)。将提取出的IDF和SDF按2∶1的比例混合作为总膳食纤维(total dietary fiber，TDF)进行研究[9]。

1.2.3 单因素试验

研究纤维素酶的添加量(4%、5%、6%、7%、8%)、超声温度(30、40、50、60、70 ℃)、超声时间(10、20、30、40、50 min)、醇沉所用乙醇的料液比(W/V)(1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6)对SDF/IDF的影响。

1.2.4 响应面优化实验

单因素中影响显著的因素为纤维素酶添加量、超声时间和超声温度，把SDF/IDF的比值作为指标，以该三种因素为条件，进行响应面法优化提取工艺。

1.2.5 膳食纤维应用性质研究

将提取的SDF、IDF以及TDF经过冷冻干燥后，对不同应用性质的进行对比评价。

1.2.5.1 持水力(water holding capacity，WHC)

将沙棘果渣中的TDF和IDF粉末分别准确称取0.300 g(m1)于离心管中，加入8.00 mL蒸馏水，充分振荡，在室温下放置12 h，5 000 r/min离心10 min，取沉淀，称取底泥沉淀物的质量为m2(g)，按公式(1)计算膳食纤维的持水力。

(1)

1.2.5.2 持油力(oil holding capacity，OHC)

将沙棘果渣中的TDF、SDF和IDF粉末分别准确称取0.300 g(m3)于离心管中，加入植物油8.00 mL，充分振荡，在室温下放置12 h后，5 000 r/min离心10 min，称取底泥沉淀物的质量为m4(g)，按公式(2)计算不同膳食纤维的持油力。

(2)

1.2.5.3 溶胀度(swelling capacity，SWC)

将沙棘果渣TDF和IDF粉末分别称取0.300 g(m5)置于10 mL的量筒中(V1，mL)，加入蒸馏水8.00 mL，充分摇匀，在室温放置12 h后，读出膳食纤维膨胀的体积(V2，mL)，按公式(3)计算膳食纤维的溶胀度(mL/g)。

(3)

1.2.5.4 不同膳食纤维对胆固醇吸附作用

绘制胆固醇标准曲线：取10.00 mL试管5支，分别加入胆固醇标准液(100 μg/mL)0.00、0.50、1.00、1.50、2.00 mL，混合均匀，在室温下，静置10 min。加入冰乙酸将溶液定容到4.0 mL，沿其管壁缓缓加入铁矾显色剂2.0 mL，充分摇匀，静置15 min。在560 nm波长处进行比色。以OD值作纵坐标，胆固醇总量作横坐标，绘制标准曲线为y=0.010 8x+0.007，相关系数R2=0.995 1。

对胆固醇吸附作用分析：取新鲜的蛋黄10.000 g，加入蒸馏水90.000 g，制成乳液。加入50.000 g乳液和2.000 g膳食纤维于200 mL广口瓶中，混合均匀。利用盐酸模拟胃部环境(pH=2.0)以及小肠环境(pH=7.0)，37 ℃下恒温均匀振荡2 h，4 000 r/min离心20 min，静置，取上清液0.04 mL，测定其中的胆固醇含量[10]。按公式(4)计算对胆固醇的吸附量(μg/g)。

(4)

式中，M：对胆固醇的吸附量(μg/g)；M1：吸附前蛋黄液中胆固醇含量(μg)；M2：吸附后上层清液中胆固醇含量(μg)；m：所用膳食纤维的质量(g)。

1.3 数据处理

每组做3次平行试验，以平均值±标准差用于结果表示。采用软件SPSS 20.0对单因素进行Tukey显著性检验，软件Origin 2019作折线图，软件DesignExpert10进行响应面设计与方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

由图1a所示，酶添加量小于5%时，随着纤维素酶的添加量的增加，沙棘果渣中SDF/IDF比值先增后减，当纤维素酶的添加量为5%时，SDF/IDF的比值最高，为0.305。此结果与Li[9]、Wu[11]、Xu[12]等研究规律相似，说明适量纤维素酶的添加可促进沙棘果渣中纤维素糖苷键断裂，形成纤维寡糖，提高SDF的含量，随着纤维素酶用量的不断增加，细胞壁与其的反应性能随之增大，会使膳食纤维水解后得到的IDF得率减少，SDF得率增多[13]，使SDF/IDF比值增大；由于细胞壁数目一定，在过高的酶添加量下，部分SDF被进一步降解，SDF得率减小，因此SDF/IDF比值降低。

随着超声温度从30 ℃升至50 ℃，SDF/IDF的比值不断增大，在50 ℃时，SDF/IDF比值增至0.267，为最大值；超过50 ℃时，SDF/IDF比值不断减小，该结果表明，在本研究中50 ℃以下温度升高有利于沙棘果渣中膳食纤维的提取。Xu[12]从黑豆中提取SDF结果显示随着超声温度的增加，SDF提取率先增加后减少，其临界温度为40 ℃，本研究与其结果趋同。这可能是由于外界温度升高，溶剂和溶质分子的运动速度不断加快，更多的膳食纤维可以克服吉布斯自由能，分子间碰撞几率增加，加快了酶促反应。然而温度过高会使得纤维素酶蛋白分子的热能增加，其间的非共价相互作用断裂的可能性增加，抑制了酶的活性甚至使酶失活，使SDF与IDF得率均减小，而在本试验中，SDF减少量比IDF减少量相对较多，因此SDF/IDF的值下降。

图1 各因素对沙棘果渣膳食纤维提取影响Fig.1 Effect of various factor on extraction of dietary fiber from H.rhamnoides pomace

随着超声时间的延长，沙棘果渣中SDF/IDF比值逐渐增加；当时间为40 min时，SDF/IDF最大，为0.314；超过40 min，比值开始降低，这与Zhang等[14]研究结果规律相似，其膳食纤维最大得率时间为35 min。可能由于随着时间的增加，超声波会使纤维素酶暴露更多的活性位点，增加了酶与底物的接触机会，同时适当的超声时间促进超声波诱导氢键断裂以及内部疏水核的分散，提高酶促反应速率，使纤维素酶充分作用，SDF不断增加，本试验中IDF增速低于SDF，因此SDF/IDF比值不断增加；然而时间过长，活性中间体与蛋白质之间的骨架作用会使酶聚集，阻碍活性位点的暴露，也使蛋白质的稳定性降低[15]，分解成小分子物质，膳食纤维因此水解，使膳食纤维产出减少[14]。本研究中，此时SDF得率明显减少，而IDF含量无明显变化，SDF/IDF比值减小。

当料液比小于1∶3时，SDF/IDF比值逐渐增大；当料液比为1∶3时，比值最大，为0.308；当料液比大于1∶3时，SDF/IDF比值先降后升，并基本保持不变。由于料液比影响因素对SDF影响不大，因此确定料液比为1∶3，以其他三种因素进行进一步分析。

2.2 响应面优化实验

2.2.1 响应面试验设计结果及模型建立

选择对膳食纤维提取结果影响显著的三个因素，分别为纤维素酶添加量(A)、超声时间(B)、超声温度(C)，并以SDF/IDF比值为响应值，进行响应面试验，结果如表1所示。

采用Box-Behnken中心组合试验对可溶性膳食纤维提取进行了工艺优化，经回归拟合，建立SDF/IDF比值与纤维素酶添加量、超声时间、超声温度的二阶多项式模型：SDF/IDF=0.22+0.006 75A-0.001 125B+0.007 625C+0.009 25AB-0.012AC+0.007BC-0.012A2-0.011B2-0.003 45C2。

表1 响应面实验方案及结果

2.2.2 回归模型显著性检验及方差分析

表2 回归模型的显著性检验及方差分析

2.2.3 响应面结果分析

用软件Design-Expert10对响应面试验的结果作曲面图(见图2)，以对各因素之间的交互作用进行进一步的研究。曲面图可以更为直观地反映出不同因素之间的交互作用[16]，曲面越陡，作用越显著。以其中的一个因素作为中心水平，研究另外两个因素的交互作用对SDF/IDF比值的影响。如图2a～2c以及表3，可见曲面较陡，AC交互作用显著(P<0.05)，SDF/IDF比值呈先增大后降低的趋势，说明回归方程存在极大值。不同条件下，SDF/IDF的比值都有一种较优的条件。

2.2.4 最佳条件确定及回归模型验证试验结果

通过响应面分析得出采用超声辅助酶的方法提取沙棘果渣中膳食纤维的含量的最优条件为纤维素酶添加量为4.877%，超声时间为42.159 min，超声温度为60.000 ℃，此时SDF/IDF比值为0.22。为适合于实际操作，调整最佳工艺为：加入5%的纤维素酶，60 ℃下超声42 min。在该条件下进行验证，得出SDF/IDF比值为0.21±0.01，与预测值相差0.01，表明模型理论预测值与实际值拟合效果良好。

图2 响应曲面图Fig.2 Response surface diagram

2.3 沙棘果渣膳食纤维应用性质结果分析

2.3.1 不同膳食纤维的持水力、持油力、溶胀度

膳食纤维生理功能的两个重要指标是水化性质和持油力，水化性质强，意味着当膳食纤维摄入后，排泄物的体积会变大、质地变软、使排泄物在体内停留的时间缩短，从而排泄频率增加，间接缓解直肠和泌尿系统的压力，可避免便秘和结肠癌[17]。由表3可知，沙棘果渣膳食纤维在持油性、溶胀度及吸附胆固醇方面表现出良好应用性质，且呈现不同的效果差异性。IDF的持水力强，TDF的溶胀力较高；SDF的持油力最低，TDF的持油力则较高。持油力可以用来评估膳食纤维吸收脂肪的能力，由于膳食纤维的结构较为疏松，有比较高的比表面积，因此膳食纤维的水化能力和持油力相对较高，对消化道中的脂肪的吸收和排泄起到促进作用[18]。

表3 沙棘果渣中不同膳食纤维应用性质

2.3.2 膳食纤维对胆固醇吸附作用结果分析

当身体摄入过多的高脂食物时，血浆中的低密度脂蛋白就会和膳食中过多的胆固醇结合，进而形成低密度脂蛋白胆固醇[19]，当低密度脂蛋白含量增多时，就会引起血栓动脉硬化的危险性上升。膳食纤维能通过吸收胆汁酸抑制小肠对胆汁酸的吸收，减少人肝中胆汁酸的含量，进而促进人体胆固醇的分解，有效降低血清和肝脏中胆固醇的含量[20]。

由表4可知，TDF在pH=2和pH=7条件下对胆固醇吸附作用极显著(P<0.01)，分别为4.79×10-3和6.42×10-3μg/g，pH=7时对胆固醇的吸附作用更高。SDF在pH=2时对胆固醇的吸附量高于pH=7时的吸附量(P<0.01)，分别为4.87×10-3和3.97×10-3μg/g，可能由于SDF中部分侧链基团在较高的pH下发生解离，影响SDF对胆固醇的吸附[21]。在pH=2时IDF对胆固醇的吸附作用极显著低于pH=7时的吸附力(P<0.01)。

不同类型的膳食纤维，对胃部环境和小肠环境中的胆固醇都有不同的吸附效应。不同的膳食纤维在胃部环境中对胆固醇吸附功能并没有明显区别，但在小肠环境中却表现出极明显的吸收差异，总膳食纤维对胆固醇吸附能力比可溶性膳食纤维提高了1.6倍以上。

本研究中，总膳食纤维以不可溶性膳食纤维为主，可溶性膳食纤维为辅的两类纤维素构成，在溶胀力方面体现出优于不可溶性膳食纤维的能力，持油作用及对胆固醇的吸附作用也分别优于可溶及不可溶性膳食纤维。因此，不同比例搭配的膳食纤维可能会表现出不同的应用性质，有待于进一步研究，利用不同膳食纤维的作用特点，可作为食品辅料、食品添加剂及功能性成分添加到不同类别需求的食品中。

表4 沙棘果渣中不同膳食纤维对胆固醇的吸附作用

3 结论

超声波与酶具有协同作用的机理是通过超声波可提高酶活性[22]，进一步提升膳食纤维得率。本研究中通过响应面优化得出最佳工艺为，添加纤维素酶量5%，超声温度60 ℃，超声功率120 W，超声时间42 min，此时SDF得率为(16±1)%，IDF得率为(73±2)%，SDF/IDF比值为0.21±0.01。相同工艺条件下，单一使用超声波时SDF得率为(12±4)%，IDF得率为(65±1)%，SDF/IDF比值为0.18±0.08；单一使用纤维素法SDF得率为(11±1)%，IDF得率为(67±1)%，SDF/IDF=0.16±0.02，可见，超声辅助酶法制备沙棘果渣膳食纤维具有显著的得率优势，且使得可溶性膳食纤维比例增加。

沙棘果渣总膳食纤维表现出良好应用性质，特别体现在溶胀力和持油力较高，分别为3.12±0.13 mL/g、(4.47±0.41)%，且对胆固醇的吸附效果良好，在pH=7时对胆固醇吸附作用高出SDF近一倍。

综上，利用沙棘加工副产物果渣能够高效制备不同类型的膳食纤维，提高资源利用率，降低产业成本，获得高附加值产品，对于进一步促进沙棘产业的发展具有一定经济价值和社会意义。