旱芹菜根乙酸乙酯部位化学成分及其细胞毒活性

杨晓军，王 超，贾云鹏，郝书苑，王雪梅，岳昌武

1延安大学化学与化工学院；2延安大学医学院，延安 716000

芹菜ApiumgraveolensL.是伞形科一年生或两年生草本植物。有西芹、旱芹等多种栽培品种，药用以旱芹为多[1]。目前国内外对旱芹化学成分的研究主要集中在地上部分的茎和叶，并从中分离鉴定出包括黄酮、萜类和香豆素等多种活性成分[2]，而对于其地下部分，特别是根部的研究却很少。虽然民间有很多关于旱芹菜根治病的小偏方，但缺乏科学的理论依据。课题组期望通过对旱芹菜根化学成分系统深入的研究来揭示其药效物质基础。前期研究已从旱芹菜根中分离鉴定出3个化合物[3]，本文继前期研究，继续对其乙酸乙酯部位化学成分进行了分离纯化，并对分离得到的单体化合物进行细胞毒活性测试，为旱芹菜根的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

X-4型显微熔点仪(上海科学仪器有限公司)；IR Prestige-21红外光谱仪(日本岛津公司)；AV-500 型核磁共振仪(瑞士Bruker公司)，TMS为内标；MAT-711型质谱仪(美国Thermo公司)；Sephadex LH-20(Pharmacia产品)；柱层析硅胶( 300～400目，青岛海洋化工厂)；硅胶GF254薄层板(50 mm×100 mm，0.20～0.25 mm，青岛海洋化工厂)；四甲基偶氮唑盐溶液(MTT)试剂(Sigma公司)；阳性对照品紫杉醇(江苏红豆杉药业有限公司，国药准字H20093763，生产批号20140628)；人肝癌细胞株BEL-7402(上海美轩生物科技有限公司)、人肺癌细胞株A549(上海继和生物科技有限公司)，人胃癌细胞株SGC-7901(上海研生生化试剂有限公司)；旱芹根于2019年10月采集自陕西省蒲城县，经延安大学生命科学院白重炎研究员鉴定为伞形科芹属ApiumgraveolensL.的根，标本存放于延安大学天然产物化学实验室，标本编号为YD20191005。

1.2 实验方法

1.2.1 提取和分离

称取旱芹根15.0 kg(干重)，用粉碎机粉碎成粉末，将此粉末装入渗漉筒中，然后每次用4倍量的工业酒精渗漉提取，共4次(12 h/次)。提取液减压浓缩得浸膏1.87 kg。将此浸膏在超声波辅助下用水溶解，抽滤得滤液和水不溶物。滤液依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，每种萃取剂的用量为3倍滤液体积，并分3次萃取；各萃取液经减压浓缩后分别得石油醚部位浸膏236 g、乙酸乙酯部位浸膏309 g和正丁醇部位浸膏552 g；将乙酸乙酯部位用硅胶柱层析分离，依次以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱(100∶0→1∶1)，洗脱馏分在薄层层析(TLC)检测下获得6个主成分段(E1～6)。各主成分段进一步进行纯化，第E1段硅胶柱层析(洗脱剂为二氯甲烷∶乙酸乙酯=50∶1)分得化合物1(54 mg)和化合物2(29 mg)；第E2段硅胶柱层析(洗脱剂为二氯甲烷∶乙酸乙酯=30∶1)分得化合物3(15 mg)；第E3段硅胶柱层析(洗脱剂为二氯甲烷∶乙酸乙酯=20∶1)分得化合物4(18 mg)和化合物5(9 mg)；第E4段硅胶柱层析(洗脱剂为二氯甲烷∶乙酸乙酯=10∶1)分得化合物6(27 mg)和化合物7(11 mg)；第E5段硅胶柱层析(洗脱剂为二氯甲烷∶乙酸乙酯=2∶1)，将主成分合并后进一步用Sephadex LH-20凝胶柱(丙酮为洗脱剂)纯化得化合物8(21 mg)；第E6段硅胶柱层析(洗脱剂为二氯甲烷∶乙酸乙酯=1∶1)，将主成分合并后进一步用Sephadex LH-20凝胶柱(甲醇为洗脱剂)纯化得化合物9(8 mg)。

1.2.2 细胞毒活性[3]

采用MTT法测试化合物1～9对肝癌细胞株BEL-7402、人胃癌细胞SGC-7901和人肺癌细胞A549的体外细胞毒活性。化合物分别用DMSO溶解后配成10 mmol/L储备液，测前稀释到适合的浓度。将3种人体肿瘤细胞制成单细胞悬浮液，接种于96孔板上，并设空白组、阳性对照组(紫杉醇)以及实验组，每组设3个平行孔，实验组为100、50、25、12.5、6.25 μmol/L的含药样品溶液，在96孔板中直接加入各个样品溶液10 μL，连续培养48 h后。再加入10 μL配制好的MTT溶液(5 mg/mL)，在CO2恒温培养箱中恒温培养，孵育后使用酶标仪测量其在波长为490 nm下的吸光度A值，按以下公式计算细胞生长抑制率。

细胞生长抑制率 =

[ (A对照-A给药)/A对照]×100%

以样品浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，利用Origin 7.0软件绘制出浓度-抑制率曲线图。样品活性结果以IC50(半数抑制浓度)表示，当抑制率为50%时的样品浓度也就是细胞毒活性的IC50值。

2 实验结果

2.1 结构鉴定

化合物1白色粉末，mp. 57.1～59.3 ℃，ESI-MS：m/z255.3 [M-H]-；分子式为C16H32O2；1H NMR(500 MHz，CDC13)δ：2.41(2H，t，J= 7.2 Hz，H-2)，1.59(2H，m，H-3)，1.38～1.21(24H，m，H-4～15)，1.03(3H，t，J= 6.9 Hz，H-16)；13C NMR(125 MHz，CDC13)δ：174.6(C-1)，34.2(C-2)，31.9(C-14)，28.8～29.4(C4～C13)，24.8(C-3)，22.7(C-15)，14.1(C-16)。以上数据和文献[4, 5]报道一致，故确定该化合物为软脂酸。

化合物2淡黄色黏稠液体；ESI-MS：m/z133.3 [M+H]+；分子式为C9H8O；1H NMR(500 MHz，CDC13)δ：9.77(1H，d，J= 7. 2 Hz，H-1)，7.52(1H，d，J= 15.6 Hz，H-3)，7.33(2H，d，J= 8.6 Hz，H-2′，6′)，7.26(2H，dd，J= 8.6，7.8 Hz，H-3′，H-5′)，7.19(1H，d，J= 7.8 Hz，H-4′)，6.74(1H，dd，J= 15.6，7.2 Hz，H-2)；13C NMR(125 MHz，CDC13)δ：187.39(C-1)，134.3(C-2)，151.5(C-3)，137.0(C-1′)，128.9(C-3′，C-5′)，126.9(C-2′，C-6′)，128.5(C-4′)。以上数据和文献[6, 7]报道一致，故确定该化合物为反式肉桂醛。

化合物3浅黄色粉末，mp. 245.8～246.7 ℃；ESI-MS：m/z295.2 [M+Na]+，271.1 [M-H]-；分子式为C15H12O5；IR(KBr)νmax3 406～3 129、2 926、2 847、1 706 cm-1；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.31(2H，d，J= 8.2 Hz，H-2′，H-6′)，6.78(2H，d，J= 8.2 Hz，H-3′，H-5′)，6.01(1H，s，H-8)，5.83(1H，s，H-6)，5.35(1H，dd，J= 11.4，2.0 Hz，H-2)，3.36(1H，d，J= 13.0 Hz，H-3a)，3.14(1H，d，J= 2.0 Hz，H-3b)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：79.7(C-2)，43.2(C-3)，196.7(C-4)，165.4(C-5)，98.3(C-6)，167.3(C-7)，95.9(C-8)，164.0(C-9)，102.7(C-10)，132.0(C-1′)，128.8(C-2′，C-6′)，115.5(C-3′，C-5′)，158.7(C-4′)。以上数据和文献[8, 9]报道一致，故确定该化合物为柚皮素(结构见图1)。

图1 化合物3～9的化学结构Fig.1 The chemical structures of compounds 3-9

化合物4浅黄色针晶，mp. 181.2～183.6 °C；ESI-MS：m/z215.6 [M+Na]+；分子式为C10H8O4。IR(KBr)νmax3 335、1 704 cm-1；1H NMR(500 MHz，CDC13)δ：7.85(1H，d，J= 9.8 Hz，H-4)，7.09(1 H，s，H-5)，6.73(1H，s，H-8)，6.22(1H，d，J= 9.8 Hz，H-3)，3.79(3H，s，7-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CDC13)δ：164.1(C-2)，108.8(C-3)143.3(C-4)，102.7(C-5)，152.5(C-6)，145.1(C-7)，113.0(C-8)，150.6(C-9)，111.7(C-10)，57.7(7-OCH3)。以上数据和文献[10]报道一致，故确定该化合物为异东莨菪素。

化合物5淡黄色粉末固体，mp. 146.9～149.1 ℃；ESI-MS：m/z217.4 [M+H]+，455.5 [2M+Na]+；分子式为C12H8O4；IR(KBr)νmax3 016、1 712 cm-1；1H NMR(500 MHz，CDC13)δ：7.38(1H，d，J= 8.9 Hz，H-4)，7.53(1H，d，J= 2.4 Hz，H-2′)，7.02(1H，s，H-5)，6.77(1H，d，J= 2.4 Hz，H-3′)，6.49(1H，d，J= 8.9 Hz，H-3)，4.15(3H，s，8-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CDC13)δ：160.9(C-2)，113.2(C-3)，143.5(C-4)，114.9(C-5)，126.1(C-6)，145.8(C-7)，136.6(C-8)，115.7(C-4a)，142.3(C-8a)，146.7(C-2′)，106.8(C-3′)，58.7(8-OCH3)。以上数据与文献报道[11]一致，故确定该化合物为花椒毒素。

化合物6白色固体，mp. 223.7～226.2 ℃；与三氯化铁反应呈阳性，提示含有酚羟基；HR-EI-MS：m/z181.165 8 [M+H]+(calcd for C9H9O4，181.166 1)；IR(KBr)νmax3 304～3 427、3 029、1 695、2 962、2 835、1 631、1 609、1 578、1 492 cm-1；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：10.29(1H，br s，7-OH)，9.28(1H，br s，5-OH)，6.69(1H，s，H-4)，5.18(2H，s，H-3)，2.36(3H，s，6-CH3)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：174.1(C-1)，71.2(C-3)，101.5(C-4)，156.1(C-5)，119.8(C-6)，159.2(C-7)，146.9(C-3a)，102.9(C-7a)，8.3(6-CH3)。以上数据与文献报道[12,13]一致，故确定该化合物为6-甲基-5，7-二羟基苯酞。

化合物7白色粉末固体，mp. 114.2～116.7 ℃；ESI-MS：m/z285.3 [M+H]+；分子式为C14H20O6；IR(KBr)νmax3 329、3 016 cm-1；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.39(2H，dd，J= 8.6，8.2 Hz，H-3，H-5)，7.24(2H，d，J= 8.6 Hz，H-2，H-6)，7.01(1H，d，J= 8.2 Hz，H-4)，4.39(1H，d，J= 7.2 Hz，H-1′)，3.78(2H，t，J= 5.2 Hz，H-8)，3.71(1H，dd，J= 10.6，3.9 Hz，H-6′a)，3.56(1H，dd，J= 10.2，2.2 Hz，H-6′b)，3.43～3.21(4H，m，H-2′，3′，4′，5′)，2.87(2H，t，J= 5.2 Hz，H-7)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：136.2(C-1)，128.3(C-3，5)，126.9(C-2，6)，125.6(C-4)，34.2(C-7)，70.5(C-8)，103.3(C-1′)，74.1(C-2′)，75.9(C-3′)，76.8(C-4′)，71.3(C-5′)，62.5(C-6′)。以上数据与文献[14,15]报道一致，故确定该化合物为2-苯基乙基-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物8白色结晶体，mp. 239～240 ℃；EI-MS：m/z431.2[M-H]；分子式为C21H20O10；IR(KBr)νmax3 528、3 387、1 669 cm-1；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：12.95(1H，br s，5-OH)，10.38(1H，br s，4′-OH)，7.95(2H，d，J= 8.6 Hz，H-2′，6′)，7.01(2H，d，J= 8.6 Hz，H-3′，5′)，6.90(1H，s，H-3)，6.85(1H，s，H-8)，6.45(1H，s，H-6)，5.19(1H，d，J= 7.2 Hz，H-1′′)，3.76(1H，dd，J= 11.2，3.8 Hz，H-6′′a)，3.61(1H，dd，J= 10.2，2.8 Hz，H-6′′b)，3.47～3.15(4H，m，H-2′′，3′′，4′′，5′′)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：164.2(C-2)，102.9(C-3)，182.3(C-4)，161.3(C-5)，101.7(C-6)，162.9(C-7)，96.9(C-8)，155.3(C-9)，104.8(C-10)，122.0(C-1′)，128.5(C-2′，6′)，117.4(C-3′，5′)，159.6(C-4′)，101.4(C-1′′)，72.8(C-2′′)，76.9(C-3′′)，70.4(C-4′′)，76.1(C-5′′)，61.3(C-6′′)。以上数据与文献[16,17]报道一致，故确定该化合物为芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物9红棕色粉末，mp. 156.9～159.2 ℃；EI-MSm/z：301.4 [M+H]+；分子式为C14H20O7；IR(KBr)νmax3 387、3 008 cm-1；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.07(2H，d，J= 8.6 Hz，H-2，H-6)，6.98(2H，d，J= 8.6 Hz，H-3，H-5)，4.31(1H，d，J= 7.2 Hz，H-1′)，3.78(1H，dd，J= 10.8，4.2 Hz，H-6′a)，3.84(2H，t，J= 4.9 Hz，H-8)，3.61(1H，dd，J= 10.0，2.0 Hz，H-6′b)，3.47～3.26(4H，m，H-2′，3′，4′，5′)，2.91(2H，t，J= 4.9 Hz，H-7)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：133.4(C-1)，129.2(C-2，6)，117.5(C-3，5)，155.9(C-4)，34.6(C-7)，70.3(C-8)，103.1(C-1′)，73.8(C-2′)，76.5(C-3′)，77.1(C-4′)，71.2(C-5′)，62.3(C-6′)。以上数据与文献[18-20]报道一致，故确定该化合物为红景天苷。

2.2 活性测试结果

化合物1～9的细胞毒活性测试结果见表1，化合物4对3种肿瘤细胞均具有不同程度的细胞毒活性，IC50< 50 μmol/L，其中，该化合物对测试人肺癌细胞A549的抑制活性最强，IC50为6.68 μmol/L；其它化合物对3种测试肿瘤细胞无明显细胞毒活性。

表1 化合物1～9的体外细胞毒活性测试结果

3 结论

本文从旱芹菜根工业酒精提取物的乙酸乙酯萃取部位共分离和鉴定出9个化合物，包括糖苷类、香豆素类、黄酮、苯酞及其他类化合物，其中化合物3、4、6、7和9首次从该属植物中分离得到。测试了化合物1～9对3种肿瘤的细胞毒活性，结果表明化合物4对3种肿瘤细胞均具有不同程度的细胞毒活性，对人肺癌细胞A549表现出较强的细胞毒活性，IC50值为6.68 μmol/L。据文献报道[21]化合物4还对人乳腺癌细胞MCF和肝癌细胞HepG2也具有良好的细胞毒活性，IC50值分别为8.58 μmol/L和4.76 μmol/L。因此，化合物4可能是旱芹菜根作为抗癌药物中的潜在有效成分，其作用机制及其体内药效仍然有待于进一步深入研究。