酶解法制备柑橘皮渣膳食纤维的理化特性及抗氧化活性

周丽玲，罗佳倩，常霞，林军，黄帆，李高阳，2

1.湖南大学研究生院隆平分院/果蔬贮藏加工与质量安全湖南省重点实验室/湖南省果蔬加工与质量安全国际科技创新合作基地，长沙 410125；2.湖南省农业科学院农产品加工研究所，长沙 410125

柑橘是世界第一大类水果[1]，我国是柑橘大国，种植面积及产量均居世界首位。柑橘果皮占柑橘全果质量的30%～50%，是柑橘加工过程中的主要副产物，每年在生产加工中产生的柑橘皮渣超过1 000万t，若不进行适当处理，会对环境、人类健康和经济造成负面影响，因此，加工副产物的高效利用已成为柑橘产业的重点发展方向[2]。

膳食纤维因其在调节肠道菌群[3]、控制血糖[4]等方面的生理功能而受到广泛关注，根据水溶性不同可将其分为水溶性膳食纤维（soluble dietary fiber，SDF）和不溶性膳食纤维（insoluble dietary fiber，IDF）。研究报道发现柑橘中SDF含量远高于豆渣、葡萄、苹果等，具有更好的功能特性[5-6]。Liu等[6]研究表明，柚子膳食纤维可改善低血糖，降低血脂水平，并对肠道菌群的丰富度和多样性具有积极影响。利用加工副产物提取柑橘纤维是一种更环保、更经济的方法，对于柑橘深加工及拓宽膳食纤维应用范围具有重要意义。

碱液浸提法因其提取率较高而常被用于膳食纤维提取[7]，但易造成化学试剂残留，对环境不友好。相比于化学提取法，酶法制备膳食纤维通常生理活性更佳，且加工特性较好。Wang等[8]采用酶法、酸法及碱提3种方法提取猕猴桃膳食纤维，发现酶法制备的猕猴桃纤维结构更松散，IDF葡萄糖吸附能力最高，SDF油脂吸附能力最高。Ma等[5]对比分析酶法及碱液浸提法对紫萝卜纤维的影响，发现酶法制备SDF的产量显著高于碱法，持油力及胆固醇吸附能力也更高。

因此，本研究选用橙类（脐橙）、宽皮柑橘（沃柑）、柠檬、柚（苹果柚）4种产量较高的柑橘作为原料，通过酶解柑橘皮渣制备膳食纤维，并对其理化性质及功能进行综合评价，以期为拓宽柑橘纤维应用范围、提高柑橘副产物综合利用率提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脐橙（Citrus sinensis（L.）Osbeck），购于湖南省邵阳市新宁县；柠檬（Citrus limoncv Fino），购于四川省资阳市安岳县；沃柑（Citrus reticulata），购于湖南省永州市武鸣县；苹果柚（Citrus maxima‘Apple’），购于湖南省常德市澧县。果实均无损伤和腐烂。

将果实洗净后剥皮，皮渣于烘箱中60℃干燥48 h，粉碎后过孔径0.178 mm筛，将柑橘皮粉置于干燥器中保存备用。参照Liu等[6]的方法分别制备脐橙纤维（NODF）、苹果柚纤维（APDF）、沃柑纤维（ODF）及柠檬纤维（LDF）于25℃的干燥器中备用。提取率按式（1）计算。

式（1）中，M1为干燥后橘皮质量，g；M2为干燥膳食纤维质量，g。

1.2 结构表征

采用扫描电镜仪（EVO LS10，德国Carl Zeiss公司）观察柑橘纤维微观结构；用红外光谱仪（Nicolet iS5，美国Thermo fisher scientific公司）、X射线衍射仪（D8 Advance，德国Bruker公司）及热重分析仪（NETZSCH STA 449 F3/F5 Jupiter，德国耐驰公司）分析柑橘纤维结构特性并计算结晶度，具体方法参考文献[9]。

1.3 粉体性质测定

采用超纯水配制0.5%柑橘纤维悬浮液，用激光粒度分析仪（LS-POP VI，欧美克科技有限公司）测定粒径分布情况；用全自动色度分析仪（Color Quest XE，美国Hunter Lab公司）测定纤维色泽；参考GB 5009.88—2014测定总膳食纤维TDF、不可溶性膳食纤维IDF及可溶性膳食纤维SDF含量；参考刘岩龙[10]的方法测定并计算纤维持水力（water holding capacity，WHC）、持油力（oil holding capacity，OHC）及溶胀性（swelling capacity，SC）；参考朱欣頔[11]的方法用流变仪（MCR302，奥地利Anton Paar公司）分析测定柑橘纤维表观黏度随剪切速率的变化规律以及在不同剪切速率下受到的剪切应力。

1.4 抗氧化活性测定

以DPPH·和ABTS+自由基清除率、铁还原能力（FRAP）为指标对柑橘纤维体外抗氧化活性进行研究。

参照万仁口等[9]的方法分别制备质量浓度为2.5、5、10、15、20 mg/mL的纤维提取液并计算自由基清除率，测定方法略作修改：DPPH溶液质量浓度为0.039 mg/mL；ABTS工作液配制方法如下：取10 mL 7 mmol/L ABTS+溶液，与10 mL 2.45 mmol/L K2S2O8混匀后避光反应12 h，使用前用无水乙醇稀释近50倍，至734 nm下检测吸光度小于0.700备用。

铁还原能力（FRAP）通常用于分析植物提取物的总抗氧化活性。FRAP测定方法：取0.1 mL待测纤维，加入3 mL预热至37℃的FRAP工作液，再加入2 mL超纯水，摇匀并于37℃水浴反应30 min。吸光度均采用紫外-可见分光光度计（UV-1800，苏州岛津仪器有限公司）测定。

1.5 数据处理

利用SPSS 18.0统计软件对数据进行单因素方差分析（Duncan’s多重比较法，P＜0.05），同时采用Pearson相关性分析及KMO检验，对测定指标进行主成分分析。用Origin 2021对数据进行绘图。

2 结果与分析

2.1 微观结构

图1为不同柑橘膳食纤维的扫描电镜图，NODF（图1A）和LDF（图1D）排布较为紧密，且NODF呈团簇结构，表面粗糙不平，可以看到颗粒碎片。APDF（图1B）结构较为疏松，表面存在孔隙。与其他3种纤维相比，ODF（图1C）表面呈蜂窝状，具有更多孔状结构，孔隙度较高。膳食纤维的生理功能受微观结构影响，空间结构疏松的膳食纤维往往具有较大比表面积，可能会影响其对水、油等的吸附能力。酶处理会导致淀粉、蛋白质等降解，可能会在纤维表面留下多孔结构和起皱的表面，这些微观结构的变化有助于增大柑橘纤维表面积并增强其吸收水分、油脂的能力。

图1 不同柑橘纤维的扫描电镜图（500×）Fig.1 The SEM photograph of different citrus dietary fiber

2.2 红外光谱

不同柑橘膳食纤维的红外光谱如图2所示。4种柑橘纤维峰形相似，说明其化学组成基本相同。所有样品红外光谱均出现3 400 cm-1处的宽吸收峰，是由于纤维素和半纤维素O—H伸缩振动引起。2 928 cm-1的峰值是来自膳食纤维中甲基和亚甲基上C—H键伸缩振动，表明存在典型多糖化合物结构。1 745 cm-1处的特征吸收峰是半纤维素中羧酸C＝O伸缩振动，是半纤维素特征吸收峰。1 647 cm-1处的吸收峰是木质素的芳香族苯环，1 010 cm-1处的峰是由于C—O—C键上C—O伸缩振动，是典型木聚糖吸收峰，表明柑橘纤维中含有木聚糖半纤维素。

图2 不同柑橘纤维的红外光谱图Fig.2 FT-IR spectra of different citrus dietary fiber

2.3 X射线衍射

如图3所示，不同柑橘纤维的特征衍射峰基本相同，说明其晶体构型较为相似。所有样品的主峰都出现在2θ为22°附近，表明样品纤维均为纤维素Ⅰ晶体构型。结晶度的降低有助于改善柑橘纤维延展性，而结晶度增加可能会增强柑橘纤维的热稳定性。经计算，4种纤维的结晶度分别为：NODF（26.83%）、APDF（27.43%）、ODF（24.09%）、LDF（26.74%）。

图3 不同柑橘纤维的X射线衍射图Fig.3 XRD of different citrus dietary fiber

2.4 热稳定性分析

不同柑橘纤维热稳定性如图4所示。柑橘纤维热分解主要分为3个阶段，第一阶段（60～160℃）对应失水，是由于柑橘纤维分子内游离水和结晶水蒸发造成纤维样品质量下降；第二阶段（160～250℃）的降解主要是半纤维素和果胶热解聚，结晶区域破坏等，样品失重率分别为：NODF（28.71%）、APDF（28.73%）、ODF（31.07%）、LDF（26.06%），柑橘纤维中SDF主要由果胶及部分半纤维素组成，脐橙、沃柑及苹果柚纤维中SDF含量高于柠檬纤维（表1），可能是导致这3种纤维在此阶段失水较多的原因；第三阶段（＞250℃）主要是由于一些木质素和复杂聚合物分解所致，4种柑橘纤维残留量分别为：NODF（24.19%）、APDF（24.40%）、ODF（24.34%）、LDF（25.12%）。

表1 不同柑橘纤维的理化和功能性质Table 1 Physicochemical and functional properties of different citrus fiber

图4 不同柑橘纤维的热重分析Fig.4 Thermogravimetric analysis of different citrus dietary fiber

2.5 粒径分布

不同柑橘膳食纤维的粒径分布如图5所示。苹果柚纤维在4种纤维中粒径最大，沃柑纤维粒径小于其他3种纤维。结晶度的降低可导致分子有序状态降低，使纤维形态减小，这可能是沃柑纤维颗粒尺寸较小的原因。随着膳食纤维颗粒尺寸的减小，其理化性质和生理活性可能会得到改善。4种纤维的平均粒径为49.31～52.75 μm，表明酶解可作为一种低粒径膳食纤维提取的有效方法。

图5 不同柑橘纤维的粒径分布Fig.5 Particle size distribution of different citrus dietary fiber

2.6 色泽及组成成分和功能性质

由表1可知，柠檬纤维L*值在4种纤维中最高，呈现浅色色泽，有益于其在浅色食品中的应用。脐橙纤维L*值显著低于其他3种纤维，根据SEM结果，脐橙膳食纤维存在团簇结构，可能使其比表面积增大，在制备过程中产生褐变，导致L*值较低，b*值较大。膳食纤维色泽对其在食品中的应用有直接影响。通过酶法制备的4种柑橘纤维都保持较相似的淡黄色，可能会限制其在浅色食品中作为配料的应用。

通过酶法制备的4种柑橘纤维主要成分均为IDF，含量达50%以上。柠檬总膳食纤维（TDF）及IDF含量均最高，分别为67.63%和56.60%。脐橙SDF含量高于其他3种柑橘纤维，为14.06%，且IDF与SDF比例较好（3.6∶1），可能对其生理活性具有一定促进作用。

沃柑纤维的持水力在4种膳食纤维中最高；脐橙、苹果柚、沃柑纤维的持油力差异不显著，柠檬纤维的略低；4种纤维的溶胀性为14.17～20.00 mL/g，脐橙纤维溶胀性最高，其余3种纤维差异不显著。

2.7 流变特性

如图6A所示，不同柑橘纤维剪切应力与剪切速率之间呈现线性关系，其中粒径最大的APDF受到的剪切应力明显高于其他纤维，可能因为纤维粒径越大，越容易形成网络，导致更多颗粒相互作用，从而使其受到更大剪切应力。

图6 不同柑橘纤维的剪切应力（A）和黏度（B）Fig.6 Shear stress（A）and viscosity（B）of different citrus dietary fiber

不同柑橘纤维黏度随剪切速率变化规律如图6B所示。结果显示，在低速率下，柑橘纤维表观黏度随着剪切速率增加而显著降低，当剪切速率继续增加时，表观黏度趋于稳定，呈剪切稀化现象。相同剪切速率下，4种柑橘纤维中，APDF表观黏度最大，ODF及NODF表观黏度较小。结合粒径分布结果发现，平均粒径较小柑橘纤维黏度较高，可能是因为较小纤维颗粒尺寸可以提供较大比表面积和填充分数，使膳食纤维具有抗流动能力。同时，根据XRD分析结果，可能是由于APDF结晶度最高（27.43%），分子内排布较为有序，分子间相互作用力较大，导致表观黏度增大，也需要更大的力来打破其晶体结构，使相同剪切速率下，APDF受到的剪切应力较大。

2.8 抗氧化活性

不同柑橘膳食纤维抗氧化活性如图7所示，4种柑橘纤维抗氧化能力均随其质量浓度的升高呈明显上升趋势，高纤维浓度对DPPH·、ABTS+自由基均有较强清除能力，且具有较好的铁还原能力。由图7A、B可知，相同质量浓度下，不同柑橘纤维抗氧化活性具有显著性差异。NODF在4种柑橘纤维中表现出最高DPPH·、ABTS+自由基清除力。

图7 不同柑橘纤维的抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activity of different citrus dietary fiber

如图7C所示，同浓度下，样品吸光度越高，表明还原力则越强，抗氧化能力也越高。可见Vc的铁还原能力显著高于柑橘纤维。4种柑橘纤维中，NODF、ODF铁还原能力显著高于APDF和LDF，与DPPH·及ABTS+自由基清除能力变化规律一致。

2.9 相关性分析

将各指标测定值进行相关性分析，结果见表2。TDF与WHC、DPPH、ABTS、FRAP呈极显著正相关，与OHC及黏度呈极显著负相关，与SC呈显著正相关；IDF与OHC呈极显著负相关，与SC呈显著负相关；SDF与WHC、OHC、SC、DPPH、FRAP呈极显著正相关，说明膳食纤维中主要是可溶性膳食纤维SDF具有水合性能及抗氧化活性。粒径与WHC、OHC、DPPH、ABTS及FRAP呈极显著负相关，证明在一定粒度范围内，膳食纤维粒径越小，其持水性及持油性越高，抗氧化活性也越强。WHC、SC与DPPH、ABTS、FRAP呈极显著正相关，说明在一定范围内，膳食纤维水合性能对其抗氧化性能具有促进作用。黏度与粒径呈极显著正相关，即粒径较大的纤维黏度较高，可能是由于纤维颗粒度较大，加强了颗粒间相互作用，导致表观黏度增大。黏度对纤维体外抗氧化活性也具有显著影响。结果显示，黏度与DPPH、ABTS及FRAP呈极显著负相关。柑橘纤维粒径与亮度L*呈显著正相关，与a*及b*呈极显著负相关，可能是因为粒径减小导致比表面积增大，反射因数随之增大，导致纤维色泽变浅。DPPH与ABTS、FRAP之间均呈极显著正相关，且相关系数大于0.7。结果表明，各表征指标间相关性较强，可采用主成分分析对不同柑橘纤维品质进行综合分析。

表2 4种柑橘纤维表征指标的相关性系数矩阵Table 2 Correction coefficient matrix of characterization index in 4 kinds of citrus dietary fiber

2.10 主成分分析

进行主成分分析前，采用KMO检验对所获数据进行适应性检验，经计算得知KMO=0.646，大于0.5，因此，可进行主成分分析。如表3所示，分析得到的3个因子特征值均大于1，累计方差贡献率达90.893%，可反映不同柑橘纤维绝大部分信息，因此提取前3个因子信息进行后续分析计算。

表3 主成分的特征值、贡献率、累计贡献率及特征向量Table 3 Principal components eigenvalues，contribution rate，accumulative contribution rate and eigenvector

由表3可知，贡献率为49.083%的第1因子中荷载值较大的有TDF含量、SDF含量、IDF含量、L*、a*、b*及OHC，主要反映纤维化学组成及色泽；第2因子贡献率为30.954%，其中荷载值较高且为正值的有WHC、FRAP、DPPH及b*，粒径及黏度为负相关；贡献率为10.855%的第3因子中，SC及ABTS、FRAP荷载值均为正值且大于0.5，主要反映柑橘纤维抗氧化和水合性能。

以3个主成分分别对应的方差贡献率占累积方差贡献率的比例作权重建立综合评价模型：F=0.540F1+0.341F2+0.119F3，综合评价结果如表4所示。脐橙纤维在第1、第3因子中的得分均最高，说明与其他品种相比，NODF在膳食纤维含量及组成、色泽方面具有优势。ODF在第2因子中得分最高，说明其在抗氧化性能方面具有最大优势。而LDF及APDF在第2因子中得分均较低，抗氧化活性较低。以不同因子贡献率为权重，根据不同品种各因子得分与相应权重乘积的累加计算得到纤维综合得分，排序为：脐橙纤维、沃柑纤维、苹果柚纤维、柠檬纤维，脐橙纤维综合品质最高，柠檬纤维品质较差。

表4 4种柑橘纤维的得分及综合评价Table 4 Score and comprehensive evaluation

3 讨论

柑橘皮渣是膳食纤维的主要来源之一，利用酶法制备脐橙、苹果柚、沃柑及柠檬皮渣膳食纤维，并分析比较其理化、结构及抗氧化活性差异。通过结构解析发现，4种柑橘纤维的红外光谱均呈现纤维素特征吸收峰，为纤维素Ⅰ晶体构型，表明酶处理未改变柑橘纤维晶型。

膳食纤维水合作用对肠道内营养物质消化吸收有直接影响，可增加饱腹感，起预防肥胖的作用，其生理功能与其表面结构密切相关。本研究表明，在一定粒度范围内，纤维粒径越小，其持水力、持油力越高，这与Huang等[12]的研究结果一致。4种柑橘纤维中，沃柑纤维WHC最高，可用作功能性食品配料，改善产品黏度和质地；根据SEM结果，沃柑纤维表面呈现蜂窝状，孔隙度较高，可能有助于吸收并保持更多水分子。酶法制备的4种柑橘纤维溶胀性均高于竹笋（5.11 mL/g）[13]、椰子（5.12 mL/g）[14]等的纤维，可能是经过酶解处理后，纤维表面淀粉残留物被去除，紧密的纤维表面被破坏形成多孔疏松的结构[15]，这些结构变化有助于提高纤维的吸附能力[16]，使柑橘纤维具有增加饱腹感的潜力，可作为一种功能食品添加剂用于预防或限制肥胖。此前的研究结果发现，SDF比IDF表现出更好抗氧化活性[9]，SDF与抗氧化能力之间存在正相关性[17]，测得脐橙纤维中SDF含量显著高于沃柑、苹果柚及柠檬纤维，可能对其抗氧化活性有增强作用；柑橘皮渣膳食纤维抗氧化活性与其浓度呈正相关，高纤维浓度具有较强的抗氧化活性；相关性分析结果表明，柑橘纤维SDF含量、WHC、SC与其抗氧化活性均呈极显著正相关。

研究表明柑橘皮渣可作为一种优质膳食纤维来源，为柑橘加工副产物综合利用提供新思路，提高柑橘加工链价值。本试验中制得4种柑橘纤维IDF占比均较大，未达到理想比例，仍需深入研究以改善SDF与IDF比例，进一步提升柑橘纤维的生理活性。