香樟叶总黄酮提取工艺优化及其抗氧化性研究

郑丽鋆，叶燕燕，吴美婷，倪 林，3*

（1.福建医科大学 附属协和医院药学部，福建 福州 350001；2.福建农林大学 植物保护学院，福建 福州 350002；3.自然生物资源保育利用福建省高校工程研究中心，福建 福州 350002）

香樟（Cinnamomum camphoravar.Linaloolifera）为樟科樟属植物［1］，有较高的药用价值，具有祛风湿、行气血、利关节的功效［2-4］。香樟主要分布在我国福建、台湾、江西、广东等地区［5］。近年来，福建多数地区广泛种植香樟，植物资源丰富，据作者统计，仅泉州安溪、南安、德化等地就已有万亩香樟林［6］。香樟叶生长量大，全年可采，挥发油含量高，是提取香樟精油的优质原料［7-8］。而在实际的生产过程中，香樟叶仅用于精油生产，随之作为燃料焚烧，而精油含量≤5%，植物利用率低，资源浪费严重［9］。

课题组前期研究发现，香樟除挥发油类成分外，还富含黄酮、酚酸类物质，且该类成分显示较好的抗氧化活性［10］。为进一步深度开发香樟植物资源，提高香樟叶利用率和价值，本研究建立响应面数学模型以优化香樟叶总黄酮加热回流的提取工艺。试验中选取提取时间、料液比以及乙醇浓度作为影响因素，并对最佳提取工艺条件下的总黄酮提取物进行抗氧化活性研究，旨在为香樟叶总黄酮的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2019年7月采自福建泉州市安溪半林国有林场的3 年生香樟叶，经福建农林大学林学院邹双全研究员鉴定为樟科樟属香樟（Cinnamomum camphoravar.linaloolifera），品系为“牡丹1 号”，自然晾干，粉碎后备用。

1.2 试剂与仪器

DPPH 试剂购自福州Phygene 生物公司；维生素C（纯度≥98%）、水杨酸（纯度≥99.5%）、ABTS（纯度≥98%）均购自合肥博美生物公司；H2O2溶液（分析纯，体积分数30%）购自江苏凯基生物公司；七水合硫酸亚铁、无水乙醇等试剂均购自国药集团公司。

PR224ZH/E 型电子分析天平：OHAUS 公司（美国）；TU-1810 紫外分光光度计：普析通用仪器公司（北京）；RV3 V 旋转蒸发仪：IKA 公司（德国）；HHW600 电热恒温水浴锅：欧莱博生物公司（济南）；RC 2 Control 冷却循环器：IKA公司（德国）。

1.3 芦丁标准曲线的绘制

配制25 mL 浓度为0.8 mg·mL-1的芦丁乙醇溶液，分别取一定体积的芦丁标准液于25 mL 容量瓶中，依次加入5%亚硝酸钠溶液0.5 mL 和10%硝酸铝溶液0.5 mL，摇匀，静置6 min；加1（mol·L-1）氢氧化钠溶液5 mL，用无水乙醇定容至刻度，摇匀静置15 min，在510 nm 波长处测定吸光度。以芦丁标准溶液X和吸光度Y绘制标准曲线。

1.4 提取工艺

1.4.1 提取工艺的基本方法

精密称取1.00 0 g（m）香樟叶粉末于圆底烧瓶中，在不同的条件下进行回流提取，总黄酮提取液经过滤后定容至100 mL（V）。取1 mL 定容后的滤液于50 mL 容量瓶中，按照“1.3”的方法测定吸光度，按以下公式计算总黄酮提取收率。

其中，n为稀释倍数，C为线性计算出的浓度。

1.4.2 单因素试验

以总黄酮提取收率为评价指标，研究3 个因素对香樟总黄酮提取收率的影响，每个因素设置5 个水平（表1），从而获得各条件下最佳提取工艺条件。

表1 单因素试验Tab.1 Single factor test

1.4.3 响应面法确定最佳工艺条件

根据单因素试验筛选出单因素的最佳工艺条件，应用Design Expert 8.0.6 软件对提取时间（A）、料液比（B）和乙醇浓度（C）设计三因素三水平的Box-Behnken 试验（表2），以总黄酮提取收率（Y）为响应值，确定香樟总黄酮提取的最佳工艺条件。

表2 响应面试验的因素与水平表Tab.2 Factors and levels of response surface experiment

1.5 体外抗氧化活性的测定

1.5.1 DPPH自由基清除能力的测定

参 照 文 献［11-12］的 方 法 略 作 修 改，取5 mg 的DPPH 溶于无水乙醇并定容至100 mL，超声5 min，得到DPPH 乙醇溶液，避光保存，并在5 h 内用完。准确称取总黄酮样品25 mg，溶于无水乙醇并定容至25 mL，得到1.0 mg·mL-1的母液，母液按照高浓度到低浓度的顺序，准确配制浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL-1的总黄酮溶液。取DPPH 乙醇溶液1 mL，加入1 mL 不同浓度的总黄酮溶液，混匀，避光反应30 min 后在517 nm 下测得吸光度A1；对照组以1 mL 无水乙醇替代DPPH 溶液，测得混合液的吸光度A2；空白组以1 mL 无水乙醇替代不同浓度的总黄酮溶液，测得混合液的吸光度A0。以维生素C 为阳性对照，按照上述同样方法进行试验。

DPPH自由基清除率（%）=［A0-（A1-A2）］/A0×100%

1.5.2 ·OH的清除能力的测定

参照文献［13-14］的方法略作修改，用最优工艺条件提取的总黄酮提取物配制成0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg·mL-1的总黄酮乙醇溶液。吸取1.0 mL 不同浓度的总黄酮乙醇溶液，加入9 mmol·L-1水杨酸乙醇溶液、9 mmol·L-1硫酸亚铁水溶液和1 mmol·L-1的H2O2水溶液各0.5 mL，混匀，在37℃下反应30 min，在510 nm 下测定吸光度A1。对照组以水杨酸乙醇溶液、硫酸亚铁水溶液、蒸馏水各0.5 mL 与总黄酮乙醇溶液1.0 mL的混合液测定吸光度A2。空白组以水杨酸乙醇溶液、硫酸亚铁水溶液、H2O2水溶液各0.5 mL与蒸馏水1.0 mL的混合液测定吸光度A0。以维生素C为阳性对照，按照上述同样方法进行试验。

·OH清除率（%）=［A0-（A1-A2）］/A0×100%

1.5.3 ABTS自由基清除能力的测定

参照文献［15-16］的方法略作修改，配制浓度为7 mmol·L-1的ABTS 溶液和2.45 mmol·L-1的K2S2O8溶液，各取5 mL 混合产生ABTS+自由基，室温避光反应16 h，使用前需用无水乙醇对该溶液进行稀释。用最优工艺条件提取的总黄酮提取物配制成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1的溶液，分别取0.5 mL，加入2.0 mL ABTS 稀释液，摇匀。混合液在37℃下反应6 min，在734 nm 下测定吸光度A1。空白组以无水乙醇代替总黄酮溶液，测得吸光度A0。以维生素C为阳性对照，按照上述同样方法进行试验。

ABTS自由基清除率（%）=（A0-A1）/A0×100%

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线绘制

以芦丁标准溶液X和吸光度Y绘制标准曲线，得回归方程为Y=6.348X-0.032 20（R2=0.999 6）。如图1所示。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 单因素试验结果

2.2.1 不同提取时间对香樟叶总黄酮提取工艺的影响

由图2可知，随着提取时间的增加，香樟叶提取的总黄酮提取收率增加，在60 min 时达到最大值为12.68%；而当提取时间大于60 min 时，总黄酮提取收率呈下降的趋势。这可能是因为提取时间越长，香樟叶中的总黄酮提取得越充分，但是时间过长也会导致部分不耐热的黄酮类化合物分解［17］。因此，选择提取时间为50、60、70 min 作为设计响应面试验的因素。

图2 提取时间对总黄酮提取收率的影响Fig.2 Effect of extraction time on total flavonoid content

2.2.2 不同料液比对香樟叶总黄酮提取工艺的影响

由图3可知，随着料液比的增大，香樟叶提取的总黄酮提取收率增加，但当料液比大于1：50 时，增幅明显变小，总黄酮提取收率趋于稳定。这是因为提取溶剂越多，香樟叶粉末与溶剂之间的接触面积越大，香樟叶的黄酮类化合物更容易转移到溶剂中，从而提取得越充分［18］。但是在工业上过高的料液比会造成溶剂的浪费和成本的升高，因此可把1：50 作为最佳的料液比，此时的总黄酮提取收率为13.71%。故选择料液比为1：40、1：50 和1：60 作为设计响应面试验的因素。

图3 料液比对总黄酮提取收率的影响Fig.3 Effect of soil-liquid ratio on total flavonoid content

2.2.3 不同乙醇浓度对香樟叶总黄酮提取工艺的影响

由图4可知，随着乙醇浓度的升高，香樟叶提取的总黄酮提取收率呈现先升高后降低的趋势；在乙醇浓度为60%时达到最大值，为14.21%。这可能是因为在乙醇浓度较低时，乙醇可以促进黄酮类化合物溶解［19］，但当浓度过高时，植物细胞外的渗透压过高，不利于总黄酮的浸出［20］。因此，选择乙醇浓度为50%、60%、70%作为设计响应面试验的因素。

图4 乙醇浓度对总黄酮提取收率的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on total flavonoid content

2.3 响应面优化设计的结果

响应面试验设计的结果如表3。应用Design Expert 8.0.6 软件以自变量提取时间（A）、料液比（B）、乙醇浓度（C）对香樟叶总黄酮提取收率（Y）的影响进行回归拟合，得多元回归方程：

表3 响应面设计与试验结果Tab.3 Response surface design and experimental results

由表4 可知，该模型方程有显著意义（P＜0.05），失拟项不显著（P=0.083 8＞0.05），说明该回归模型可以充分反映出香樟叶总黄酮的提取效果，并做出良好预测。二次项A2和B2对总黄酮的提取效果显著（P＜0.05），二次项C2对总黄酮的提取效果极显著（P＜0.01），一次项A、B、C和交互项AB、AC、BC对总黄酮的提取效果不显著（P＞0.05），各因素影响程度依次为C（乙醇浓度）＞A（提取时间）＞B（料液比）。

表4 方差分析Tab.4 analysis of variance

从图5可见，各响应面图的曲面均为开口向下，都有最高点，而且等高线图的最小椭圆中心处于所取试验因素条件范围内，说明香樟叶总黄酮提取收率在各因素设置的范围内具有最大值。此外，AC（提取时间和乙醇浓度交互作用）的响应面曲面的坡度最大、等高线最密，说明提取时间和乙醇浓度的交互作用对响应值（总黄酮提取收率）的影响最为显著，而且总黄酮提取收率在提取时间为60 min附近出现峰值，在乙醇浓度为60%附近出现峰值。而BC（料液比和乙醇浓度的交互作用）的响应面曲面坡度的陡峭程度和等高线密集程度次于AC，故料液比和乙醇浓度的交互作用影响响应值的显著性程度次之，而且总黄酮提取收率在料液比1：50附近出现峰值，在乙醇浓度为60%附近出现峰值。可见，各因素间交互作用对响应值影响的显著性程度顺序依次为AC＞BC＞AB，分析结果与上述回归模型系数的显著性分析结果吻合。

图5 交互效应响应面图Fig.5 Interaction effect response surface

2.4 最佳提取工艺验证

通过Design Expert 8.0.6 软件对回归方程模型进行拟合分析，得到了香樟叶总黄酮的最佳提取工艺条件为：提取时间58.71 min，料液比1：50.70（g·mL-1），乙醇浓度61.01%，总黄酮提取收率预测值为14.370 5%。考虑试验的可操作性，调整为提取时间59 min，料液比1：51（g·mL-1）和乙醇浓度61%，进行三次重复验证试验。结果显示，香樟叶总黄酮提取收率为（14.39±0.48）%，符合预期结果。

2.5 香樟总黄酮体外抗氧化活性

2.5.1 DPPH自由基的清除能力

从图6可见，随着总黄酮浓度的增加，其DPPH·清除能力逐渐增强。在总黄酮浓度为0.8 mg·mL-1时，DPPH·清除率的增幅趋于平缓并接近维生素C，而在总黄酮浓度为1.0 mg·mL-1时清除率达到最大值，为87.03%。

图6 香樟总黄酮和维生素C对DPPH自由基的清除能力Fig.6 Scavenging ability of total flavonoids and vitamin C on DPPH free radicals

2.5.2 ·OH的清除能力

如图7所示，增加总黄酮的质量浓度，其·OH 的清除能力逐渐增强。在浓度为0.4～1.6 mg·mL-1时，总黄酮的·OH 的清除率均大于与维生素C。在总黄酮浓度为1.6 mg·mL-1时，·OH 的清除率增幅趋于平衡，而在浓度为2.0 mg·mL-1时达到最大值，为97.05%。可见，香樟总黄酮具有较强的·OH 清除能力。

图7 香樟总黄酮和维生素C对·OH的清除能力Fig.7 Scavenging ability of total flavonoids and vitamin C on·OH free radicals

2.5.3 ABTS+自由基的清除能力

香樟总黄酮清除ABTS+自由基的能力与浓度的关系如图8 所示。在浓度为0.2～0.8 mg·mL-1时，总黄酮ABTS+自由基的清除率以较大的幅度升高。当浓度大于0.8 mg·mL-1时，ABTS+自由基的清除率达到98.10%以上，非常接近维生素C 的清除能力。可见，香樟总黄酮具有较强的ABTS+自由基清除能力，并在大于0.8 mg·mL-1浓度时与维生素C 的清除能力相当。

图8 香樟总黄酮和维生素C对ABTS自由基的清除能力Fig.8 Scavenging ability of total flavonoids and vitamin C on ABTS free radicals

3 讨论与结论

为进一步挖掘香樟叶的利用价值和提高其利用率，本研究利用Box-Behnken 响应面法设计三因素三水平响应面试验对香樟叶总黄酮的回流提取工艺进行优化，并对香樟总黄酮进行体外抗氧化活性测定。结果表明，香樟总黄酮的最佳提取工艺条件为：提取时间59 min，料液比1：51（g·mL-1）和乙醇浓度61%，总黄酮提取收率达到（14.39±0.48）%，与预测值接近，说明该工艺优化条件稳定可行。对最佳提取条件下的总黄酮提取物进行体外抗氧化活性探究，发现对DPPH 自由基、OH·自由基和ABTS 自由基都有较强的清除作用。在浓度大于0.8 mg·mL-1时，ABTS+自由基的清除率达到98.10%以上，与维生素C 的清除能力相当。而在浓度为0.4～1.6 mg·mL-1时，总黄酮的·OH 的清除率均大于维生素C，在浓度为2.0 mg·mL-1时达到最大值，为97.05%。可见，香樟叶总黄酮具有较强的抗氧化活性，是一种潜在的抗氧化剂。本研究为进一步深度开发香樟植物资源提供了一种新思路，为提高香樟叶利用率和价值提供了科学依据。