维药胡桐泪的多糖含量测定及其糖组成分析

柳菁菁 施松善 张彬锋* Maeng Yoo Jae

1. 乐金生活健康化妆品研发(上海)有限公司，上海 200233；2. 上海中医药大学，上海 201203

胡桐泪,又名胡桐律，梧桐泪，梧桐律[1]，为杨柳科植物胡杨Populuseuphratica的树脂，主要分布于我国新疆、内蒙古、甘肃、青海等地。胡桐泪是一种少用中药和维吾尔族用药，味苦、咸，性寒，主治牙痛、咽喉肿痛[2]。《本草纲目》中记载其 “今治口齿家多用，为最要之物”[3]；《海药本草》记载其“主风疳齿，牙疼痛，骨槽风劳”[4]。胡桐泪主要有两种常见性状，一种外观呈不规则的颗粒状小块或小薄片状，多相互黏结成疏松的团块，表面棕黄色至棕色，具角质样光泽，质脆易碎，习称新式胡桐泪；另有一种树脂入土时间较长，呈大小不等的块状或粉末状，土黄色，质重而实，习称老式胡桐泪[5]。两种胡桐泪均为胡杨树脂流入土中留存多年而形成，区别在于树脂入土时间长短不同，但目前对两种胡桐泪药材现代研究及临床区别的认识却十分有限。文献检索结果[6-7]显示，胡桐泪的成分研究主要集中在萜类等化合物方面，而对其中的大分子多糖类的研究尚未见报道，故对市场上实际流通的商品胡桐泪药材中的多糖进行研究，以期为胡桐泪药材系统质量评价和在化妆品中的应用提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 ME104电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；DHG-9030A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；JP-300C高速多功能粉碎机(永康市久品工贸有限公司)；HWS-26电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)；N-1300D-WB旋转蒸发仪(日本东京理化器械株式会社)；Milli-Q超纯水仪；Spark多功能酶标仪(瑞士TECAN公司)；Bruker Avance Ⅲ HD 600 MHz核磁共振波谱仪；Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国Agilent)带示差检测器(RID)；色谱柱为Shodex KS-805、KS-804串联柱。

1.2 试药 葡萄糖(D-Glc)、半乳糖(D-Gal)、阿拉伯糖(L-Ara)、甘露糖(D-Man)、木糖(D-Xyl)、鼠李糖(L-Rha)等单糖标准品购自美国Sigma-Aldrich公司；不同分子量的葡聚糖标准品购自Shodex SHOWA DENKO公司。苯酚、浓硫酸、乙醇均为分析纯试剂，购自国药集团上海试剂有限公司;重水购自Damas-Beta公司;马来酸购自北京百灵威科技有限公司。

1.3 实验药材 实验样品共10批，购自中药材市场，经上海中医药大学吴立宏教授鉴定，按外观分为新式胡桐泪HT1-HT4和老式胡桐泪HT5-HT10。实验标本存放于乐金生活健康化妆品研发(上海)有限公司本草研究Team实验室。样品信息见表1 。

表1 胡桐泪药材收集信息表

2 方法

2.1 胡桐泪多糖含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备 取葡萄糖对照品约 10 mg，精密称定，加去离子水溶解并定容至 100 mL，摇匀，即得。标准葡萄糖浓度为101.2 μg/mL。

2.1.2 供试品溶液的制备 取胡桐泪粉末(过四号筛)约0.5 g，精密称定，置100 mL圆底烧瓶中，加入80%乙醇50 mL回流1 h取出，放冷，滤过，弃去滤液，残渣用80%乙醇50 mL洗涤5次后晾干。残渣于100 mL圆底烧瓶中，精密加水 50 mL，称定重量，回流提取 1 h，取出，放冷，用水补足损失的重量，混匀，滤过。精密量取滤液 40 mL，加水定容至 50 mL，混匀，即得。

2.1.3 标准曲线的绘制 精密量取对照品溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.5、0.8、1.0 mL于具塞试管中，分别加水补足至2.0 mL，精密加入6%苯酚溶液1.0 mL，涡旋后匀速加入98%浓硫酸 5.0 mL，混匀，静置至室温。在490 nm波长下测定吸光度，以葡萄糖的质量数y为纵坐标，吸光度x为横坐标绘制回归曲线(如图1所示)，得回归方程为y=216.93x-17.546(相关系数R2=0.9994，线性范围为0～202.4 μg)。计算结果表明，在实验条件下所得回归方程线性关系良好。

图1 葡萄糖标准曲线图

2.1.4 样品含量测定 取2.1.2项下的供试品溶液0.2 mL，加水稀释至2 mL，照2.1.3项下方法测定吸光度，依标准曲线方程计算出供试品溶液中含葡萄糖的量(多糖含量以无水葡萄糖计)。

2.1.5 样品水分含量测定 取胡桐泪药材粉末约 2 g，精密称定，照中国药典2020版四部[8]通则0832水分测定法第二法(烘干法)测定，结果见表2。

表2 苯酚-硫酸法测定胡桐泪样品多糖含量结果(按干燥品计算)

2.1.6 方法学考察 ①精密度试验：取胡桐泪样品约0.5 g，精密称定，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.1.3项下方法连续测定6次，记录吸光度值，计算吸光度值的RSD为0.84%，表明仪器精密度良好； ②重复性试验：取HT4样品6份，每份约0.5 g，精密称定，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.1.3项下方法测定吸光度值，并计算多糖含量，6份平均含量为5.97%，RSD为2.66%，表明重复性良好；③稳定性试验: 对同一供试品溶液，分别于30、40、50、60、90 min 测定吸光度，计算吸光度值的RSD为1.16%，表明供试品溶液在90 min内稳定； ④加样回收率试验:取HT4样品6份，每份约0.25 g，精密称定，分别加入无水葡萄糖对照品约 14.8 mg，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.1.3项下方法测定吸光度，计算含量和回收率，结果如表3。

表3 加样回收率试验结果

2.2 糖组成分析方法

2.2.1 标准单糖图谱测定步骤 ①分别取单糖标准品(葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖、鼠李糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸)1～2 mg，各加入72%的硫酸20 μL，重水200 μL，浓硫酸10 μL和内标溶液10 μL，混匀，转移入3 mm核磁管中； ②于600 MHz核磁共振仪上，设定采样温度20 ℃，测定氢谱，放大水峰区域，准确测量水峰中心频率，精确到0.1 Hz； ③另测一个氢谱，脉冲程序改为zgcppr，D1设为 10 s，扫描次数16次， O1值设为前述水峰精确频率值，采集实验数据； ④图谱以马来酸峰(6.4734 ppm)为参照校准化学位移； ⑤分别记录分析每种单糖所有构型的H1α和H1β，记录化学位移值δ、计算耦合常数J以及各单糖α-和β-构型端基氢的积分面积，计算不同构型的比例。所收集的10个样品均未检出岩藻糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，其余6个标准单糖异头碳上端基氢信号区域(约4.50～5.40 ppm)重叠模式图谱和种类归属如图2所示，数据归属详见表4。

图2 实验条件下6种标准单糖端基氢区域的核磁共振氢谱图

表4 标准糖及样品在实验条件硫酸重水溶液中端基氢的化学位移值(δ)、峰形、耦合常数(J)及不同构型的比例

2.2.2 样品溶液制备与氢谱测定步骤 ①称取多糖样品2～3 mg，加72%硫酸20 μL，混匀，室温静置过夜；② 加重水200 μL，混匀；③ 转入5 mL安瓿瓶中，封口，100 ℃水解4～5 h； ④取出，放冷至室温，加浓硫酸10 μL，内标溶液10 μL，混匀；⑤ 离心，取上清液200 μL转入3 mm核磁管中；后续测定同2.2.1项下②～⑤步骤。将样品数据与标准糖数据比对，确定单糖种类并计算各单糖之间的相对比例以其各自H1总峰面积之比计算即为摩尔比。

2.3 HPGPC分析方法 采用不同标准葡聚糖分子量的对数值与保留时间制作标准曲线，根据总多糖样品中各峰的保留时间与标准曲线对照，采用GPC软件自动计算其分子量。分别选取新式样品和老式样品多糖含量较高的代表性样品HT1和HT6制备总多糖溶液，分别进样20 μL至Aglient 1100型高效液相色谱仪，色谱柱Shodex KS-805、KS-804串联柱，流动相为0.22 μm滤膜过滤过的0.2 mol/L NaCl水溶液，流速为0.8 mL/min，柱温为40 ℃，检测器为示差检测器，记录图谱，计算各峰分子量。

3 结果

3.1 胡桐泪样品总多糖的含量测定结果 取2.1.2项下供试品溶液，按2.1.4项下方法计算胡桐泪样品中的总多糖含量(以葡萄糖计)。结果见表3。 新式胡桐泪样品HT1多糖含量较高，为9.49%；老式胡桐泪样品中HT6多糖含量较高，为2.39%。表5实验结果显示，新式胡桐泪中的多糖含量均值明显高于老式胡桐泪。

表5 不同性状胡桐泪样品多糖含量平均值比较

3.2 单糖组成分析结果 按2.2项下方法步骤，分别测定标准单糖和各样品的氢谱(如图3所示)。HT7和H10两个样品不含多糖，未做分析。通过与标准糖谱图比对测定值(见表4)，鉴定出8个样品HT1、HT2、HT3、HT4、HT5、HT6、HT8和HT9中均含有较高含量的半乳糖和阿拉伯糖，及少量的木糖、鼠李糖和甘露糖；其中，HT5、HT8、HT9样品中检测出了较高含量的葡萄糖。利用峰面积归一化法测定了各单糖组分的相对摩尔比。见表6。

图3 实验条件下标准糖及胡桐泪多糖样品端基氢区域的核磁共振氢谱图

表6 峰面积归一化法计算样品中各单糖组分的摩尔比 (%)

3.3 HPGPC分析结果 按2.3项下的方法对新式和老式胡桐泪的代表性样品HT1和HT6总多糖的分子量与分子量分布进行了测定。色谱图如图4所示，分子量计算结果见表7。

图4 胡桐泪样品多糖的HPGCP图谱

表7 不同性状的2种代表性胡桐泪样品总多糖的平均分子量及分布系数测定结果

4 讨论

实验结果表明，新式胡桐泪中多糖含量明显高于老式胡桐泪，且多糖分子量及分子量分布差异较大。推测可能与老式药材入土时间较长有关，随着时间的推移受土壤中微生物的作用而降解，从而多糖含量较低。基于两种类型胡桐泪的这些差异，以及其明显的外观区别，建议分开使用。胡桐泪总多糖的糖组成分析结果表明，不同产地不同性状胡桐泪样品的糖组成相似，主要由阿拉伯糖和半乳糖组成，且含量比例接近1∶1,推测胡桐泪中的多糖可能主要为AG型果胶多糖(阿拉伯半乳聚糖)。10份市场流通中的胡桐泪样品中，HT5、HT8、HT9样品糖组成较其他样品稍有差异，均检测出葡萄糖成分，推测是产地原因造成的差异。

文献报道糖组成的测定方法主要有薄层色谱法、纸色谱法、液相色谱法、气相色谱法、核磁共振氢谱法[9-10]等。与其他几种色谱法相比，实验采用的核磁共振氢谱法在数分钟内即可完成采样分析，与相同条件下的单糖标准品谱图对照即可明确鉴定所含单糖种类，对各单糖特征峰积分即可获得不同单糖的组成比例，而在水解液中加入一定量的内标物质，即可对每一种单糖进行绝对定量。