双重相对定量SD-qPCR在快速诊断性染色体变异中的应用

孙 雷， 龙 驹， 樊祖茜， 吴素萍， 林桂先， 凌秀明

（1.西安交通大学医学部，陕西 西安 710061；2.钦州市妇幼保健院基因与遗传实验室，广西 钦州 535099；3.钦州市妇幼保健院检验科，广西 钦州 535099）

性染色体病又称性染色体异常综合征，是指由性染色体（X或Y）的数目异常或结构畸变引起的疾病。性染色体病有多种类型，但都有共同的临床特征，即性腺发育不全或两性畸形。性染色体非整倍性是目前新生儿中最常见的染色体变异，总发病率为1/400，大约是唐氏综合征发病率的2倍[1]。男性性染色体异常主要表现为47，XXY和47，XYY等异常，也可表现为48，XYYY、48，XXYY、48，XXXY或49，XXXXY等性染色体四体或五体异常，女性主要表现为性染色体单体45，X和性染色体三体47，XXX，也可表现为48，XXXX和49，XXXXX等X染色体四体或五体异常[2]。另外，还易出现1个或多个克隆的细胞失去或获得性染色体，即发生性染色体嵌合体。最常见的性染色体嵌合体包括45，X/46，XX、46，XX/47，XXX、46，XY/47，XXY[3]。性染色体的异常率和异常种类非常多，因此对性染色体的产前诊断具有非常重要的临床意义。

基于短串联重复序列的荧光定量聚合酶链反应（short tandem repeat-quantitative fluorescent polymerase chain reaction，STR-QFPCR），多重连接探针扩增技术和荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）等技术可以实现非整倍体的检测[4-8]，但是由于需要特殊检测仪器或操作相对繁琐，不利于批量检测。传统的实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）由于不需要扩增后的产物再处理步骤，在扩增的同时即可得到检测结果，因此具有快速、简便的特点。然而，由于传统的荧光定量PCR采用的是不同的引物扩增不同的序列来进行相对定量，不同引物的扩增效率存在差异，从而导致检测结果的稳定性不足[9]。本课题组前期建立了基于重复序列的荧光定量聚合酶链反应（segmental duplication-quantitative polymerase chain reaction，SD-qPCR）方法，提高了对21号染色体诊断的稳定性和可靠性[10]。据此，本课题组又开发出一种可进行双重相对定量的SD-qPCR方法，以期能实现对其他染色体的快速检测及单管多位点的检测。

1 材料和方法

1.1 临床样本

收集197例羊水样本，所有样本经染色体G显带核型分析，其中性染色体数目正常样本185例、45，X样本5例、47，XXX样本3例、47，XXY样本2例、47，XYY样本2例。

1.2 重复序列的筛选

从美国国立生物技术信息中心（the National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库（http：//www.ncbi.org）中筛选出染色体间的重复序列分子标记，重复序列分子标记的一个位点必须位于性染色体（X或Y染色体），另一个位点位于性染色体以外的其他染色体。

1.3 引物和探针的设计

以筛选出的重复序列为目的序列，设计引物和探针。在重复序列碱基完全相同的部位设计公共扩增引物，使其能同时等效扩增重复序列的2个片段；在有碱基差异的部位设计各自的特异性检测探针，使其能分别检测出目的序列和参考序列的扩增量。

1.4 双重相对定量SD-qPCR反应体系与参数

检测仪器为CFX96实时荧光定量PCR仪（美国伯乐公司）。反应体系：总体积25 μL，模板DNA 2 μL、2对引物（5 μmol/L各0.5 μL）、引物对应的TaqMan探针（5 μmol/L各0.5 μL）、2×TaqMan Universal PCRMaster Mix[天根生化科技（北京）有限公司]12.5 μL、ddH2O 5.5 μL。热循环条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，68 ℃1 min，循环5次，不收集荧光；然后95 ℃ 15 s，68 ℃ 1 min，于68 ℃时收集荧光，循环36次。

1.5 临床样本的检测

采用建立的双重相对定量SD-qPCR方法检测197例羊水样本，并根据16号染色体与X染色体间的重复序列2-ΔΔCt值来判断X染色体的数目，1号染色体与Y染色体间的重复序列相对定量2-ΔΔCt值来判断Y染色体的数目。将所有检测结果与染色体核型分析结果进行对比，以判断所建方法的准确性和可靠性。

2 结果

2.1 SD-qPCR引物和探针设计

经N C B I数据库筛选出了2对重复序列分子标记，定位于1 6号染色体（NC_000016.10）、X染色体（NC_000023.11）和1号染色体（NC_000001.11）、Y染色体（NC_000024.10），可分别用于检测X和Y染色体的数目。SD-qPCR的引物设计原理及方法见图1。

图1 SD-qPCR引物设计原理及方法

2.2 SD-qPCR的浓度梯度检测

采用SD-qPCR检测不同浓度（160、32、6.4、1.28、0.256和0.128 ng/μL）的DNA，结果显示，除DNA浓度为0.128 ng/μL时无扩增外，其他DNA浓度均能有效扩增，SD-qPCR的扩增曲线和标准曲线结果见图2。

图2 SD-qPCR的浓度梯度扩增曲线和标准曲线

计算不同DNA浓度的变异系数（coefficient of variation，CV）。对于16号染色体与X染色体间的重复序列，不同DNA模板浓度下ΔCt值的CV分别为6.37%、2.38%、5.65%、5.57%和8.82%。对于1号染色体与Y染色体间的重复序列，不同DNA模板浓度ΔCt值的CV分别为6.51%、3.47%、3.94%、6.73%和8.23%。

2.3 SD-qPCR检测样本的2-ΔΔCt值

性染色体拷贝数可根据16号染色体和X染色体、1号染色体和Y染色体的2-ΔΔCt值来判断。样本不同X和Y染色体数目的2-ΔΔCt值为：胎儿为女性或无Y染色体的样本2-ΔΔCt（1-Y）值为0，有1条Y染色体的样本2-ΔΔCt（1-Y）值为0.84～1.30，有2条Y染色体的样本2-ΔΔCt（1-Y）值为1.90～2.01；胎儿为男性或仅1条X染色体的样本2-ΔΔCt（16-X）值为0.37～0.65，有2条X染色体的样本2-ΔΔCt（16-X）值为0.87～1.13，有3条X染色体的样本2-ΔΔCt（16-X）值为1.34～1.45。各2-ΔΔCt值之间无相互重叠的情况，因此根据2-ΔΔCt值即可有效判断X和Y染色体的数目。

2.4 临床样本的检测结果

采用双重相对定量SD-qPCR检测197例羊水样本，其中性染色体数目正常的样本185例、45，X样本5例、47，XXX样本3例、47，XXY样本2例、47，XYY样本2例，检测结果与染色体核型分析结果一致。不同染色体核型的双重相对定量SD-qPCR检测结果分布见图3。

图3 不同染色体核型的双重相对定量SD-qPCR结果分布

3 讨论

在人类基因组DNA中，不仅包含单一拷贝的DNA序列，还有大量的串联重复序列（卫星DNA、小卫星DNA和微卫星DNA）和分散重复序列。串联重复序列中的卫星和小卫星DNA主要分布于着丝粒或端粒，常作为FISH技术的分子标记应用于遗传疾病的诊断[5]。微卫星DNA也被称为短串联重复序列（short tandem repeat，STR），可与定量PCR结合构成STR-QF-PCR技术，用于常见染色体非整倍体的快速诊断[4]。分散重复序列是指重复单位并不相连，散布在整个基因组染色体各位点的序列，对其临床应用方面的研究目前还较少。本研究采用的重复序列相当于只有2个拷贝的分散重复序列，是位于不同染色体上的2段具有碱基高度相似，但又有部分碱基数目或结构差异的序列。

理想的重复序列分子标记应该是重复序列的两端引物设计处碱基完全相同，而中间用于定量检测的探针部分又有2个以上的碱基差异。这样才能保证2个序列扩增效率的一致性，以及定量结果的特异性和准确性。通过多次的筛选和验证，本研究成功筛选出2对重复序列分子标记，分别位于16号染色体、X染色体和1号染色体、Y染色体上。本研究采用2对引物和4条荧光探针同时扩增并检测相应的染色体，从而开发了一种新的双重相对定量SD-qPCR方法，双重相对定量SD-qPCR的检测结果与传统的染色体核型分析结果一致，具有良好的准确性和稳定性。

本研究采用双重相对定量SD-qPCR对不同浓度梯度的DNA模板进行扩增，除在0.128 ng/μL浓度条件下无扩增外，DNA浓度为0.256～160 ng/μL时，所有的位点均能有效扩增，表明该技术的检出限可达0.256 ng/μL。另外，本研究对各个浓度梯度的ΔCt值进行了CV分析，发现当DNA浓度为32 ng/μL时，16号染色体与X染色体间相对定量ΔCt值的CV为2.38%，1号染色体与Y染色体间的相对定量ΔCt值的CV为3.47%，该浓度的CV最小，表明该检测体系的最佳模板浓度为32 ng/μL。

在前期研究中，我们主要通过比较待测样本与正常样本的ΔCt值差异来判断待测样本的基因或染色体的拷贝数[10]。通过ΔCt值区间的统计分析，可以有效检出同一个批次待测样本的染色体拷贝数，具有简便和直观的特点。但当PCR仪器、试剂或DNA质量有变化时，ΔCt值的波动会相对较大。因此，ΔCt值分析不适用于不同批次间的分析比较。鉴于此，本研究统一采用2-ΔΔCt值对样本进行分析[11]，Y染色体拷贝数可通过1号染色体和Y染色体重复序列的2-ΔΔCt（1-Y）值来判断，X染色体拷贝数可通过16号染色体与X染色体重复序列的2-ΔΔCt（16-X）值来判断，有效避免了采用ΔCt值分析的不足。

传统的相对定量PCR虽然具有快速和简便的特点，但存在稳定性差和检测位点少等缺点。（1）检测的稳定性：传统的荧光定量PCR在基因表达量检测方面应用较多[12-13]，具有较好的准确性和重复性，原因主要是在科研实验全过程中，人员、试剂和仪器等条件基本没有变化，但当涉及不同的实验室或人员、仪器等出现变动时，极其微小的差异就会导致扩增效率的改变，从而导致假阴性或假阳性结果[14]。（2）多位点的检测能力：传统的PCR检测由于稳定性不足，不同探针或引物间的干扰较大，一般只能进行单重相对定量PCR检测[15]，即单管只能检测1条序列或染色体。本研究建立的双重相对定量SD-qPCR方法使用的2对重复序列的扩增引物完全相同，从根本上解决了传统PCR技术稳定性不足的问题，并可以实现单管四色荧光双重相对定量PCR检测，单管即可同时检测4条染色体。

综上所述，建立的双重相对定量SD-qPCR方法与传统的PCR相比，具有检测位点更多、检测结果更稳定的优点。本方法不仅具有重要的临床推广和应用价值，同时也可为其他染色体数目异常的分子诊断方法的建立提供参考。